[發(fā)明專(zhuān)利]一種土壤微生物宏基因組DNA的提取方法及相應(yīng)的試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710810584.2
• 申請(qǐng)日: 2017-09-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107418952A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 艾紅霞;束文圣;葉脈;徐卓菲;張傳倫;李猛
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣東美格基因科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物基因組DNA的提取技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種土壤微生物宏基因組DNA的提取方法及相應(yīng)的試劑盒。

背景技術(shù)

極端環(huán)境是指具有極端高溫，低溫，高壓，高氧，高鹽，高輻射，干旱，極端酸性或堿性，高重金屬含量等特征的環(huán)境。典型的極端環(huán)境包括火山，沙漠，熱泉，鹽湖，海底熱液口，極地等。極端環(huán)境微生物類(lèi)型多樣，在地球上分布非常廣泛，研究其生命活動(dòng)具有重要的理論研究和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前研究微生物的方法主要有兩種，即傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)法和免培養(yǎng)法。環(huán)境生存著大量微生物，但可培養(yǎng)的微生物只占1％左右，而大部分的微生物由于種種原因，是無(wú)法培養(yǎng)獲得的。

宏基因組方法通過(guò)提取樣品中的總基因組，避開(kāi)了微生物分離培養(yǎng)的問(wèn)題，增加了發(fā)現(xiàn)新物種的機(jī)會(huì)，可以全面客觀地反映樣品中微生物的多樣性。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和測(cè)序成本大幅度的降低，利用宏基因組學(xué)研究極端微生物的群落結(jié)構(gòu)成為微生物生態(tài)研究的一個(gè)重要內(nèi)容。宏基因組學(xué)的研究對(duì)象是特定環(huán)境中全部微生物總DNA，因此DNA提取是宏基因組研究成功的關(guān)鍵步驟，高質(zhì)量DNA獲取是高通量測(cè)序的基礎(chǔ)。

用于高通量測(cè)序宏基因組研究的DNA需要滿(mǎn)足兩個(gè)條件，既要盡可能獲得樣品中所有微生物的基因，又要保證片段的完整度和DNA純度。目前，用于高通量測(cè)序或者構(gòu)建基因組文庫(kù)的基因組DNA一般采用SDS法(十二烷基苯磺酸鈉)、CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨)或基于硅膠基質(zhì)的吸附離心柱等方法提取。市場(chǎng)上也有很多商用基因組提取試劑盒都可高效地提取細(xì)菌基因組 DNA，但是這些試劑盒都是針對(duì)可培養(yǎng)的細(xì)菌，而針對(duì)免培養(yǎng)微生物效率則非常低。由于極端環(huán)境條件下微生物含量極少，而且特別是有些含有大量鹽離子，極端的酸性堿性條件等嚴(yán)重困擾DNA的提取。采用常規(guī)DNA提取方法或普通試劑盒提取宏基因組DNA效率低，豐度欠佳，無(wú)法獲得純度高、質(zhì)量?jī)?yōu)的宏基因組DNA。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于：克服現(xiàn)有常規(guī)的極端環(huán)境土壤微生物DNA提取時(shí)存在的提取效率低、無(wú)法滿(mǎn)足測(cè)序要求等問(wèn)題，提供一種快速、簡(jiǎn)易的土壤微生物宏基因組DNA的提取方法，該方法提取得到的DNA具有高豐度、高濃度、高純度、雜質(zhì)少等優(yōu)點(diǎn)，便于后續(xù)高通量分析。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種土壤微生物宏基因組DNA的提取方法，其包括如下步驟：

(1)將體積比為2:3～3:2的待測(cè)土壤樣品與緩沖液A混合、50～55℃孵育 15～20min、離心去上清后，加入緩沖液A和溶菌酶37℃孵育30min～1h，再經(jīng) 20mg/ml蛋白酶K與CTAB 37℃處理20～30min，然后加入濃度為20％的SDS， 65～68℃裂解細(xì)胞1～2h，離心獲得含DNA的上清液和沉淀；

(2)在步驟(1)所得沉淀中加入緩沖液B和濃度為20％的SDS混合、 65～68℃水浴15～20min然后-80℃冷凍10～15min，反復(fù)凍融三次后，離心取上清液，與步驟(1)所得上清液混合；步驟(1)所得沉淀與緩沖液B的體積比為 1:3～3:2；濃度為20％的SDS與緩沖液B的體積比為1:1～9；

(3)加入等體積的苯酚:氯仿:異戊醇抽提蛋白，再用異丙醇進(jìn)行沉淀1～2h；將混合液加入到離心純化柱中，經(jīng)離心洗滌TE洗脫后收集離心管中液體，即為土壤微生物宏基因組DNA溶液；

其中，所述緩沖液A的pH為8.0，包括0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl，0.1M NaH₂PO₄和0.1M Na₂HPO₄；

所述緩沖液B的pH為8.0，包括0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl， 0.1M NaH₂PO4、0.1M Na₂HPO₄和1wt％CTAB。

作為本發(fā)明土壤微生物宏基因組DNA的提取方法的一種優(yōu)選技術(shù)方案，上述土壤微生物宏基因組DNA的提取方法，其包括如下步驟：

(1)將體積比為3:2的待測(cè)土壤樣品與緩沖液A混合、55℃孵育20min、離心去上清后，加入緩沖液A和溶菌酶37℃孵育30min～1h，再經(jīng)20mg/ml蛋白酶K與CTAB 37℃處理20min，然后加入濃度為20％的SDS，65℃裂解細(xì)胞 1～2h，離心獲得含DNA的上清液和沉淀；