[發(fā)明專利]一種土壤微生物宏基因組DNA的提取方法及相應(yīng)的試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710810584.2
• 申請(qǐng)日: 2017-09-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107418952A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 艾紅霞;束文圣;葉脈;徐卓菲;張傳倫;李猛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東美格基因科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種土壤微生物宏基因組DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將體積比為2:3～3:2的待測(cè)土壤樣品與緩沖液A混合、50～55℃孵育15～20min、離心去上清后，加入緩沖液A和溶菌酶37℃孵育30min～1h，再經(jīng)20mg/ml蛋白酶K與CTAB 37℃處理20～30min，然后加入濃度為20％的SDS，65～68℃裂解細(xì)胞1～2h，離心獲得含DNA的上清液和沉淀；

(2)在步驟(1)所得沉淀中加入緩沖液B和濃度為20％的SDS混合、65～68℃水浴15～20min然后-80℃冷凍10～15min，反復(fù)凍融三次后，離心取上清液，與步驟(1)所得上清液混合；步驟(1)所得沉淀與緩沖液B的體積比為1:3～3:2；濃度為20％的SDS與緩沖液B的體積比為1:1～9；

(3)加入等體積的苯酚:氯仿:異戊醇抽提蛋白，再用異丙醇進(jìn)行沉淀1～2h；將混合液加入到離心純化柱中，經(jīng)離心洗滌TE洗脫后收集離心管中液體，即為土壤微生物宏基因組DNA溶液；

其中，所述緩沖液A的pH為8.0，包括0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl，0.1M NaH₂PO₄和0.1M Na₂HPO₄；

所述緩沖液B的pH為8.0，包括0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl，0.1M NaH₂PO4、0.1M Na₂HPO₄和1wt％CTAB。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤微生物宏基因組DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將體積比為3:2的待測(cè)土壤樣品與緩沖液A混合、55℃孵育20min、離心去上清后，加入緩沖液A和溶菌酶37℃孵育30min～1h，再經(jīng)20mg/ml蛋白酶K與CTAB 37℃處理20min，然后加入濃度為20％的SDS，65℃裂解細(xì)胞1～2h，離心獲得含DNA的上清液和沉淀；

(2)在步驟(1)所得沉淀中加入緩沖液B和濃度為20％的SDS混合、65℃水浴15min然后-80℃冷凍15min，反復(fù)凍融三次后，離心取上清液，與步驟(1)所得上清液混合；步驟(1)所得沉淀與緩沖液B的體積比為1:3，濃度為20％的SDS與緩沖液B的體積比為1:5；

(3)加入等體積的苯酚:氯仿:異戊醇抽提蛋白，再將異丙醇進(jìn)行沉淀1h；將混合液加入到離心純化柱中，經(jīng)離心洗滌TE洗脫后收集離心管中液體，即為土壤微生物宏基因組DNA溶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述土壤微生物宏基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟(1)中，所述加入緩沖液A和溶菌酶37℃孵育時(shí)間為1h。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述土壤微生物宏基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟(1)中，所述裂解細(xì)胞的時(shí)間為2h。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述土壤微生物宏基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟(1)中，所述經(jīng)20mg/ml蛋白酶K與CTAB 37℃處理20min中，每5～10min顛倒混勻一次。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述土壤微生物宏基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟(3)中，所述TE洗脫的次數(shù)為多次。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述土壤微生物宏基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟(3)中，所述TE洗脫的次數(shù)為3次。

8.根據(jù)權(quán)利要求1～7中任意一條權(quán)利要求所述土壤微生物宏基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述土壤為極端環(huán)境極低生物量的土壤。