[發(fā)明專利]在透射電鏡下觀察捕食螨生殖系統(tǒng)的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710808936.0
• 申請(qǐng)日: 2017-09-09
• 公開（公告）號(hào): CN108267468A
• 公開（公告）日: 2018-07-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王恩東;張桂娟;張正偉;周緒寶;胡學(xué)軍;王俊偉;李金萍;王俊俠;祝保英;龐博;安樹杰;陳海明;姜曉環(huán);王伯明;呂佳樂(lè);吳圣勇;楊靜逸;何永娟;李紅波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所;首伯農(nóng)（北京）生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): G01N23/22
• 分類號(hào): G01N23/22
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.在透射電鏡下觀察捕食螨生殖系統(tǒng)的方法，其特征是先獲取植綏螨科捕食螨生殖系統(tǒng)，再制備其透射樣本的方法，具體操作步驟為：

（1）植綏螨科捕食螨生殖系統(tǒng)獲取：是先獲得交配中的捕食螨雌螨、雄螨，再通過(guò)乳酸浸泡、脫水、干燥處理，最后獲取捕食螨生殖系統(tǒng)，具體操作為：

1）交配中雌雄螨的獲取：在顯微鏡下，從捕食螨飼養(yǎng)種群內(nèi)，挑出卵單獨(dú)飼養(yǎng)至成螨后進(jìn)行雌雄螨配對(duì)，根據(jù)不同需要將處于交配過(guò)程中不同時(shí)間的雌雄個(gè)體連同飼養(yǎng)裝置一起放置于超低溫冰箱（-80℃）或液氮中，從而獲得不同交配時(shí)期的雌雄螨；

2）乳酸浸泡：取出交配中的捕食螨雌雄螨后，用細(xì)毛筆將雌雄螨放置到載玻片上，再用0號(hào)昆蟲針和細(xì)毛筆將雌雄個(gè)體分開，最后將雌雄螨分別挑入到盛有乳酸的指形管中，常溫放置3-4天；

3）脫水：從指形管中取出雌螨或雄螨或?qū)烧咭黄鸱湃?0％的酒精中，再進(jìn)行梯度脫水，酒精的濃度依次為80％、90％、100％，具體是操作是先用膠頭滴管將上層酒精吸出，然后再加入下一梯度的酒精，如此循環(huán)直到100％的酒精；

4）干燥：將所取雌螨、雄螨樣品置于樣品臺(tái)上，利用真空干燥儀進(jìn)行干燥2～3小時(shí)；

5）生殖系統(tǒng)獲取：經(jīng)過(guò)干燥后的蟲體在體視顯微鏡下可以清楚地看到在所取捕食螨雌螨、雄螨樣品周圍部分呈透明色，只留下中間一塊橙色的部位即為捕食螨的生殖系統(tǒng)，最后在顯微鏡下用0號(hào)昆蟲針將螨體的背板輕輕揭掉，取出橙色部分即成功分離出的捕食螨生殖系統(tǒng)；（2）生殖系統(tǒng)透射樣本的制備，先后操作順序包括固定、脫水、包埋、固化、切片、染色和觀察7個(gè)步驟，具體為：

1）固定：將取下的生殖系統(tǒng)放入濃度為3.5%戊二醛的固定液中，為了使固定效果更好，可向戊二醛中加入吐溫100（1L:600uL）和氯化鈉（1L:0.9g），固定48小時(shí)，然后用濃度為0.1mol/l、PH值為7.2的磷酸緩沖液沖洗（10分鐘/次），沖洗3小時(shí)，再用鋨酸固定2小時(shí)，最后用磷酸緩沖液沖洗3-4遍；

2）脫水：沖洗后，需要對(duì)生殖系統(tǒng)進(jìn)行梯度脫水，分別放在30%、50%、70%、80%、90%、100%的酒精中進(jìn)行脫水，每個(gè)梯度脫水5分鐘，再用丙酮脫水15分鐘，4-5次；

3）包埋：留少許丙酮溶液，加入樹脂溶液，將樣品和樹脂充分混合，浸泡12小時(shí)，然后將生殖系統(tǒng)整齊地放入樹脂模具中擺正姿態(tài)，趕走樹脂內(nèi)氣泡；

4）固化：趕走氣泡后，將模具放入35度烤箱中烘烤2-3周；

5）切片：再利用超薄切片機(jī)切片 50-60nm；

6）染色：用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色1小時(shí)左右；

7）觀察：在透射電鏡下對(duì)切片觀察、拍照。