[發(fā)明專利]哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆方法和使用的培養(yǎng)液

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710806337.5
• 申請(qǐng)日: 2017-09-08
• 公開（公告）號(hào): CN107460208B
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許曉椿;王小武;郭晶;遲大明;鐘原;王娜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津博裕力牧科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/877
• 分類號(hào): C12N15/877;C12N5/10
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• 代理人: 暫無信息

1.一種哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆的方法，該方法包括以下處理哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆胚的步驟：

1)將待移植的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞注入到去核后的卵母細(xì)胞并進(jìn)行電融合，在電融合后1h，挑選成功融合的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆胚進(jìn)行以下激活處理：首先在含5μmol/L離子霉素的mSOF溶液中室溫孵育4min，然后在含2mmol/L的6-DMAP和1μmol/L的Oxamflatin的mSOF溶液中，在38.5℃、5%CO₂、飽和濕度條件下培養(yǎng)4h；

2)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆胚在進(jìn)行激活處理后，轉(zhuǎn)移到含0.5~1.5μmol/L的Oxamflatin的G1.3培養(yǎng)液中，在38.5℃、5%CO₂、飽和濕度條件下培養(yǎng)4~12h，再用G1.3培養(yǎng)液清洗多次，繼續(xù)在G1.3培養(yǎng)液中培養(yǎng)至72h；然后將哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆胚轉(zhuǎn)移到G2.3培養(yǎng)液中繼續(xù)在38.5℃、5%CO₂、飽和濕度條件下培養(yǎng)至第7d；

其中：所述哺乳動(dòng)物選自牛、羊、犬、馬、豬；

所述哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆胚是通過基于體細(xì)胞核移植構(gòu)建的；

所述mSOF溶液是以SOF培養(yǎng)液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包含有體積分?jǐn)?shù)2%的BME、體積分?jǐn)?shù)1%的MEM、體積分?jǐn)?shù)1%的ITS、1mmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的鏈霉素；

步驟1)中進(jìn)行激活處理時(shí)，所用的mSOF溶液中與Oxamflatin一起還增補(bǔ)添加了相對(duì)于Oxamflatin而言4摩爾倍量的甘油，并且還增補(bǔ)添加了相對(duì)于Oxamflatin而言2摩爾倍量的蔗糖；

步驟2)中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，所用的G1.3培養(yǎng)液中與Oxamflatin一起還增補(bǔ)添加了相對(duì)于Oxamflatin而言4摩爾倍量的甘油，并且還增補(bǔ)添加了相對(duì)于Oxamflatin而言2摩爾倍量的蔗糖。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆胚在進(jìn)行激活處理或培養(yǎng)時(shí)，Oxamflatin的濃度均為1μmol/L。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(2)中在飽和濕度條件下培養(yǎng)8h。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的G1.3培養(yǎng)液上還覆蓋有石蠟油，并預(yù)先在CO₂培養(yǎng)箱中平衡至少2h。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的G1.3培養(yǎng)液中，液滴大小為120~150μL，每個(gè)液滴中放18~20枚哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆胚。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的去核后的卵母細(xì)胞的制備為：在去核前，卵母細(xì)胞先在含有7.5μg/ml細(xì)胞松弛素B、10μg/ml Hoechst 33342和體積濃度10%FBS的PBS溶液中孵育15min；然后在顯微操作儀下，用內(nèi)徑為20μm的去核管吸取第一極體及其周圍的卵胞質(zhì)，紫外光照射吸出的卵胞質(zhì)團(tuán)從而檢查去核情況；完全去除第一極體及染色體的卵母細(xì)胞應(yīng)用于核移植。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞注入后的電融合的操作為：挑選直徑為15~20μm的待移植的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞，注入到去核的卵母細(xì)胞透明帶下；在進(jìn)行電融合前，重構(gòu)體在電融合液中預(yù)平衡3min；將重構(gòu)體的供體、作為受體的去核的卵母細(xì)胞膜接觸面與兩電極的連線垂直，融合參數(shù)為電壓32V、脈沖時(shí)為20μs、2次脈沖間隔10ms。

8.一種在哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆方法的體細(xì)胞克隆胚激活過程中使用的培養(yǎng)液，其為包含2mmol/L的6-DMAP和1μmol/L的Oxamflatin的mSOF溶液；所述mSOF溶液是以SOF培養(yǎng)液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包含有體積分?jǐn)?shù)2%的BME、體積分?jǐn)?shù)1%的MEM、體積分?jǐn)?shù)1%的ITS、1mmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的鏈霉素；所用的mSOF溶液中與Oxamflatin一起還增補(bǔ)添加了相對(duì)于Oxamflatin而言4摩爾倍量的甘油，并且還增補(bǔ)添加了相對(duì)于Oxamflatin而言2摩爾倍量的蔗糖。

9.一種在哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆方法的體細(xì)胞克隆胚體外培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)液，其為包含0.5~1.5μmol/L的Oxamflatin的G1.3培養(yǎng)液； 所述G1.3培養(yǎng)液中與Oxamflatin一起還增補(bǔ)添加了相對(duì)于Oxamflatin而言4摩爾倍量的甘油，并且還增補(bǔ)添加了相對(duì)于Oxamflatin而言2摩爾倍量的蔗糖。