[發(fā)明專利]哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆方法和使用的培養(yǎng)液

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710806337.5
• 申請(qǐng)日: 2017-09-08
• 公開（公告）號(hào): CN107460208B
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許曉椿;王小武;郭晶;遲大明;鐘原;王娜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津博裕力牧科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/877
• 分類號(hào): C12N15/877;C12N5/10
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• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明公開了一種哺乳動(dòng)物例如牛或犬或羊的體細(xì)胞克隆方法和使用的培養(yǎng)液。其中哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆的方法包括以下處理哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆胚的步驟：1)將待移植的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞注入到去核后的卵母細(xì)胞并進(jìn)行電融合，在電融合后1h，挑選成功融合的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆胚進(jìn)行激活處理；2)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆胚在進(jìn)行激活處理后，轉(zhuǎn)移到G1.3培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。還涉及上述方法中使用的培養(yǎng)液。本發(fā)明方法呈現(xiàn)如說明書所述優(yōu)異技術(shù)效果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物特別是哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆胚的處理方法，例如涉及一種牛或犬體細(xì)胞克隆胚的處理方法，特別是涉及一種基于體細(xì)胞核移植構(gòu)建的哺乳動(dòng)物例如牛或犬體細(xì)胞克隆胚的處理方法。本發(fā)明哺乳動(dòng)物例如牛或犬體細(xì)胞克隆胚的處理方法能夠克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的一種或多種缺陷并且呈現(xiàn)如本發(fā)明的述一個(gè)或多個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)。

背景技術(shù)

哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆是一項(xiàng)具有巨大研究和商用價(jià)值的技術(shù)，可應(yīng)用到治療性克隆，疾病模型，人類器官移植，動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究，頻臨滅絕動(dòng)物品種保護(hù)，優(yōu)良家畜品種擴(kuò)增等方面。但至今體細(xì)胞克隆效率仍然不高，顯著制約著此技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

目前認(rèn)為，克隆效率低下的主要原因是供體哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核沒有被受體卵胞質(zhì)完全的重編程，即重編程失敗或不完全。此重編程過程中沒有涉及基因序列的變化，主要是表觀遺傳修飾的變化。表觀遺傳修飾主要包括組蛋白乙酰化和DNA甲基化兩方面。

(2E)-5-[3-(Phenylsulfonylamino)phenyl]-pent-2-en-4-ynohydroxamicacid，中文名：(2E)-5-[3-(苯基磺酰基氨基)苯基]-戊-2-烯-4-炔異羥肟酸，又稱為Oxamflatin，CAS151720-43-3，其是一種表觀遺傳修飾藥物，是去組蛋白乙酰化酶的抑制劑。(2E)-5-[3-(Phenylsulfonylamino)phenyl]-pent-2-en-4-ynohydroxamic acid的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

Oxamflatin為羥肟酸rC(OH)＝NOH的異構(gòu)體。具微酸性，微溶于水。易水解為羧酸與羥胺。加熱時(shí)發(fā)生洛森重排成異氰酸酯。與高價(jià)金屬如鐵等形成深色絡(luò)合物。用酯與羥胺反應(yīng)制取。Oxamflatin可以抑制去組蛋白乙酰化酶，從而提高組蛋白乙酰化水平。Oxamflatin已經(jīng)有應(yīng)用于腫瘤治療的臨床報(bào)道。

現(xiàn)有技術(shù)已有諸多關(guān)于哺乳動(dòng)物例如牛或犬體細(xì)胞克隆胚的方法，然而這些技術(shù)仍然存在一種或多種技術(shù)缺陷。因此，本領(lǐng)域仍然期待有新的方法進(jìn)行哺乳動(dòng)物例如牛或犬體細(xì)胞克隆胚，例如仍然期待有新的方法進(jìn)行哺乳動(dòng)物例如牛或犬體細(xì)胞克隆胚的方法，例如基于體細(xì)胞核移植構(gòu)建。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，提供一種新的方法來處理哺乳動(dòng)物例如牛或犬體細(xì)胞克隆胚，例如提供一種基于體細(xì)胞核移植構(gòu)建的處理哺乳動(dòng)物例如牛或犬體細(xì)胞克隆胚的方法，例如，在哺乳動(dòng)物例如牛或犬體細(xì)胞注入去核的卵母細(xì)胞并進(jìn)行電融合之后，對(duì)融合后的牛或犬克隆胚用(2E)-5-[3-(苯基磺酰基氨基)苯基]-戊-2-烯-4-炔異羥肟酸進(jìn)行處理，提高哺乳動(dòng)物例如牛或犬體細(xì)胞克隆囊胚質(zhì)量和發(fā)育率。本發(fā)明人出人意料的發(fā)現(xiàn)，通過使用本發(fā)明方法能夠解決一種或多種現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。

為此，本發(fā)明第一方面提供了一種哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆方法，該方法包括以下處理哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆胚的步驟：

1)將待移植的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞注入到去核后的卵母細(xì)胞并進(jìn)行電融合，在電融合后1h，挑選成功融合的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆胚進(jìn)行以下激活處理：首先在含5μmol/L離子霉素的mSOF溶液中室溫孵育4min，然后在含2mmol/L 6-DMAP和1μmol/L Oxamflatin的mSOF溶液中，在38.5℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)4h；[6-DMAP系6-二甲基氨基嘌呤的簡(jiǎn)稱]