[發明專利]一種甜瓜單倍體的創制方法

在審

• 申請號: 201710805270.3
• 申請日: 2017-09-08
• 公開（公告）號: CN107517850A
• 公開（公告）日: 2017-12-29
• 發明（設計）人: 戴照義;王運強;劉志雄;郭鳳領;龔鈺
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院經濟作物研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 龔瑩瑩

技術領域

本發明涉及植物組織培養和育種技術，具體涉及一種甜瓜單倍體的創制方法。

背景技術

甜瓜是重要的園藝作物之一，新品種的推廣和普及對于甜瓜生產的發展具有非常重要的作用。選育優質、豐產、抗逆性強、兼抗多種甜瓜主要病害、適應性強的甜瓜品種是甜瓜育種工作的發展方向。但傳統的甜瓜育種方法存在分離后代難以穩定、聚合多種目標性狀難度大，育種周期長，育種效率低等問題。僅靠傳統的常規育種方法和現有種質資源難于育成突破性的品種。

單倍體育種方法利用花藥培養、未受精子房培養以及輻射花粉授粉誘導后胚搶救等方法誘導產生單倍體，再對單倍體進行加倍，使每個單倍體帶有的單一的染色體加倍成對，成為具有正常活力、能夠正常結實的純合體，其遺傳性狀穩定、不再產生分離，經過篩選后可直接作為育種材料加以利用。單倍體育種具有育種周期短(從雜交到獲得穩定的純系只需要2個世代的時間)、育種效率高(單倍體的基因型和表現性一致，提高了主要性狀篩選的可靠性)，是目前在很多作物上廣泛采用的一種育種方法。

目前單倍體育種在水稻等禾本科作物和十字花科蔬菜上應用較多，主要是花粉等小孢子培養。葫蘆科蔬菜利用小孢子培養誘導單倍體比較困難，目前應用較多的是大孢子培養。甜瓜目前采用小孢子途徑沒有獲得過成功，現在創制甜瓜單倍體都是采用大孢子途徑，包括子房離體培養、胚珠離體培養和孤雌生殖誘導單倍體胚。前兩種方法誘導單倍體的成功與否以及誘導的頻率影響因素多，試驗難度大；而孤雌生殖誘導單倍體胚，方法相對簡單，技術可重復性好，成功率高，但誘導效率不高。針對上述問題，本發明采用輻射滅活花粉誘導甜瓜孤雌生殖，然后進行胚搶救創制甜瓜單倍體，方法簡單，成功率高，誘導效率高。

發明內容

本發明的目的在于解決甜瓜大孢子培養誘導甜瓜單倍體效率較低的問題，提供了一種甜瓜單倍體的創制方法，該方法簡單、高效，適用于大規模推廣。

為了達到上述目的，本發明采取如下技術措施：

一種甜瓜單倍體的創制方法，包括下述步驟：

1)取清晨開花前的甜瓜雄花，滅活；

以上所述的方案中，優選的，在甜瓜雄花開放當日清晨，雄花開放前，摘取雄花，裝入防水紙袋，用⁶⁰Coγ射線輻射300-400Gy進行滅活；

2)用步驟1)中的雄花花粉對前一日套袋隔離、當日開放的雌花進行授粉，授粉后繼續對雌花進行套袋隔離；

3)在授粉后的第11或12天，摘下經過授粉的子房，將表皮清洗干凈，在超凈工作臺上用酒精溶液浸泡后再用升汞溶液浸泡進行消毒，無菌水沖洗后，用無菌紙吸干幼果表面水分，將幼果橫切成3-5mm的薄片，挑取幼胚，接種于MS培養基上；

以上所述的方案中，優選的，所述的酒精為75％體積比的酒精，浸泡時間為30-60s；所述的升汞溶液的濃度為0.1％(質量比)，浸泡時間為8-10min；無菌水沖洗3-5次；

4)在MS培養基上培養10-12天的幼胚，挑取轉為綠色的胚，轉到配方為MS+0.3-0.5mg/L6-BA(細胞分裂素)+2.5％-3.5％Suc(蔗糖)+0.6％-1.0％Agar(瓊脂)+0.15mg/L活性炭的誘導培養基上進行誘導培養，至芽長出；所述的百分比均為質量百分比；

5)取小植株的芽或葉片0.2-0.3cm²，制備單細胞懸浮液，濃度為1.0×10⁵-1.0×10⁷個/mL，用流式細胞儀進行檢測；

6)將檢測為單倍體的植株轉到配方為MS+0.3-0.5mg/L 6-BA(細胞分裂素)+0.8-1.2mg/LNAA(萘乙酸)+3％Suc(蔗糖)的生根培養基上誘導生根；所述的百分比均為質量百分比。

7)當植株根系發育適宜時，開始煉苗，先將三角瓶封口打開，置于常溫下生長2-3d，然后取出植株，洗凈根部培養基，放入三角瓶中，倒入清水生長3-4d，再將植株移栽到裝有基質的育苗缽，遮陰2-3天后，轉為正常管理。

以上所述的方案中，優選的，甜瓜品種為白富康M288，所述的基質包括:草炭：珍珠巖＝1:1，體積比。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：

1、利用300-400GY的⁶⁰Coγ射線對甜瓜花粉進行滅活，在胚搶救過程中可獲得更多的綠色胚，獲得的單倍體植株最多；

2、通過調整培養基中蔗糖濃度、激素水平，并添加適量活性炭，使芽誘導效率大幅提高到25～30％，單倍體植株再生誘導率大于1.15％，并且正常苗的比例最高；