[發明專利]一種用于CYP2C19*2檢測的電化學傳感器

在審

• 申請號: 201710803959.2
• 申請日: 2017-09-06
• 公開（公告）號: CN107723340A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 于超;張成麗;趙一璘
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于CYP2C19*2檢測的電化學傳感器，其特征在于包括以下步驟：

(1)羧基化的富勒烯(c-C₆₀)-二氧化鈰(CeO₂)-鉑納米粒子(PtNPs)-ssDNA檢測探針的制備；

(2)建立電化學DNA生物傳感器，測定CYP2C19*2基因，繪制標準曲線。

2.根據權利要求1所述c-C₆₀-CeO₂-PtNPs-ssDNA復合物的制備過程，其特征包括以下步驟：

(1)c-C₆₀-CeO₂納米復合材料的制備：

首先，將10mg c-C₆₀溶解于5mL超純水中，置于室溫下超聲處理15min，得到均勻的懸浮液。接著，將10mL 0.025M Ce(NO₃)₃·6H₂O與10mL 0.025M的HTMA混合。然后將兩種溶液混合并保持在80℃的水浴中5小時，室溫冷卻后用超純水離心洗滌3次。隨后，將所制備的沉淀物在60℃下干燥，供下一步使用。接著，將20mg c-C₆₀/CeO₂復合物分散在5mL乙醇中，超聲處理15分鐘，得到分散溶液。然后，將0.1mL的APTES與上述溶液混合，并置于70℃條件下保持1.5小時。冷卻至室溫后，用超純水離心洗滌，得到的c-C₆₀/CeO₂復合體。最終將制備的產品在50℃下干燥，再進一步使用。

(2)c-C₆₀-CeO₂-PtNPs納米復合材料的制備：

通過NaBH₄還原法合成了c-C₆₀/CeO₂/PtNPs。首先，向1mL的c-C₆₀/CeO₂溶液(2mg/mL)中加入1mL的H₂PtCl₆(1％)，并超聲處理5分鐘。然后在攪拌條件下將2mL NaBH₄(0.1M)溶液滴加到混合物中，反應30分鐘，然后離心洗滌3次，并溶解在1mL的超純水中進一步使用。

(3)c-C₆₀-CeO₂-PtNPs-ssDNA復合物的制備

將所制備的1mL c-C₆₀/CeO₂/PtNPs與200μL(1μM)氨基修飾的信號探針(SP)混合，并在4℃下輕輕攪拌24小時。然后，將1mg BSA與1mL TE緩沖液混合后，加入到c-C₆₀/CeO₂/PtNPs溶液中，繼續在4℃下輕輕攪拌4小時，用于阻斷非特異性結合位點。然后，以8000rpm離心c-C₆₀/CeO₂/PtNPs/SP/BSA生物共軛物，用PBS洗滌3次，分散在1mL雜交溶液中進一步使用。

3.根據權利要求1所述的建立電化學DNA生物傳感器，測定CYP2C19*2基因，繪制標準曲線，其特征在于包括以下步驟：

(1)分別用0.3和0.05μm的Al₂O₃粉末將電極拋光成鏡面，然后分別按超純水、無水乙醇、超純水的順序超聲電極各5min，室溫干燥備用；

(2)將6μL電極修飾材料金納米粒子@鐵的金屬有機框架(AuNPs@Fe-MOFs)滴加在電極表面，室溫干燥。

(3)將10μL，100μg mL^-1親和素結合在干燥后的電極表面(4℃，12h)。

(4)用超純水將電極沖洗干凈后滴加10μL，1μM生物素標記的DNA捕獲探針溶液，4℃孵育12h。

(5)用超純水將孵育后的電極沖洗干凈后滴加6μL，1％的BSA溶液室溫孵育30min。

(6)將上述BSA封閉后的電極用清洗緩沖液(10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，37mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.4)沖洗干凈并在氮氣中干燥。

(7)將不同濃度的目標DNA滴加在電極上并置于37℃雜交2h。

(8)在干燥后的電極上滴加10μL檢測探針混合液置于37℃孵育2h。

(9)將孵育后的電極用清洗緩沖液沖洗干凈后置于氮氣中干燥。

(10)將電極置于5mL，0.1M PBS(0.1M Na₂HPO₄，0.1M KH₂PO₄，0.1M KCl)中進行表征，每隔50s加入20μL，1.4M H₂O₂，測量其計時電流變化電流值。

(11)根據所得電流變化值與CYP2C19*2基因DNA片段濃度呈線性關系，繪制工作曲線。