[發明專利]一種用于CYP2C19*2檢測的電化學傳感器

在審

• 申請號: 201710803959.2
• 申請日: 2017-09-06
• 公開（公告）號: CN107723340A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 于超;張成麗;趙一璘
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明涉及一種在臨床上定量診斷CYP2C19*2等位基因檢測的電化學傳感器的制備方法及應用，尤其是基于富勒烯納米復合材料作為信號探針制備的夾心型生物傳感器，用于檢測CYP2C19*2等位基因，屬于電化學檢測領域。

背景技術：

氯吡格雷是目前應用最為廣泛的抗栓藥物之一，可用于治療動脈粥樣硬化性心腦血管疾病包括缺血性腦卒中、心肌梗死和周圍動脈疾病，是急性冠脈綜合征(ACS)和經皮冠狀動脈介入治療(PCI)術后預防缺血性事件發生、改善臨床預后的常規藥物。氯吡格雷作為一種前體藥物，需經細胞色素P450(CYP)轉變為活性代謝物發揮抗血小板作用。在臨床應用方面，氯吡格雷使用非常特殊，如果其活性成分在血液中濃度過高將導致出血，而濃度過低則會導致血管栓塞等副作用。氯吡格雷在血液中活性成分的濃度高低與個體遺傳背景密切相關。因而，影響CYP功能降低的基因突變會減少氯吡格雷活性代謝產物的血藥濃度，從而限制了氯吡格雷的效用，嚴重者產生副作用。大量的研究表明，CYP2C19的基因突變與CYP功能降低有關。其中，CYP2C19*2與低濃度的氯吡格雷活性產物密切相關。原因主要有兩個方面，一方面，CYP2C19功能喪失(LOF)基因型[特別是CYP2C19*2，(rs4244285，c.681G＞A)]攜帶者體內氯吡格雷的活性代謝物水平較低。另一方面，積累的研究表明，CYP2C19*2的分布頻率高于其他基因突變。

目前，指導臨床用藥標準，現代最精準的是檢測基因型。在2011年在美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，FDA)對氯吡格雷發出黑框警告：氯吡格雷代謝較慢者不能有效地將其轉化為活性產物因而不能充分發揮抗血小板效應，醫務人員應根據患者的情況進行CYP2C19基因檢測，對突變型患者考慮選用其他抗血小板藥物或調整氯吡格雷的治療劑量。因此，有效檢測CYP2C19*2的基因型有利于指導該藥物個體化治療，同時推進精準醫學的發展。目前，已經報道的檢測CYP2C19*2的常規技術有DNA測序、實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)和限制性片段長度多態性分析(PCR-RFLP)。然而，這些方法存在樣品處理繁瑣、成本高、需要高精度設備，不能實現對該基因的快速定量分析。因此，尋找具有高性價比、高度靈敏的檢測方法實現對CYP2C19*2的快速定量檢測是當前急需解決的問題。

在電化學生物傳感器分析技術中，為了提高檢測的靈敏度和縮短響應時間，滿足臨床上痕量物質的定量快速檢測，目前多采用“三明治”型的傳感器反應模式。其原理是基于構建負載捕獲探針(CP)-被測目標DNA(TP)-標記信號探針(SP)夾心生物復合物的分析方法。其中，信號探針標記物主要起到增強、放大信號、提高檢測靈敏度的作用，故具有舉足輕重的地位。本實驗擬采用羧基化的富勒烯(c-C₆₀)、二氧化鈰(CeO₂)、鉑納米粒子(PtNPs)合成新的信號納米材料復合物，用于固載信號探針，通過催化過氧化氫產生電信號來實現信號放大，最終實現血液中痕量DNA的檢測。二氧化鈰(CeO₂)納米顆粒由于其較強的吸附能力，獨特的輔助催化性能和能夠增強電極與電極修飾材料之間的電子轉移效應而受到極大地關注。由于上述優點，CeO₂已廣泛應用于催化領域。然而，CeO₂在生物傳感器中的穩定性還有待提高。為了解決這一問題，本實驗使用c-C60這一穩定性高，比表面積大，機械性能好，分散性好的納米材料。不僅可作為載體來固載更多的CeO₂，而且可以提高CeO₂的穩定性。此外，為了充分發揮CeO₂的輔助催化作用，本課題引入PtNPs。由于其具有顯著的電催化活性、對氨基和硫醇基團的強吸附力，它不僅可以用于催化過氧化氫放大電化學信號，而且可以固載氨基修飾的信號探針。總的來說，CeO₂和PtNPs具有協同催化過氧化氫作用，從而實現了信號放大，c-C₆₀在固載更多的CeO₂和PtNPs的同時，增加了信號材料的穩定性。而且因為有PtNPs的存在，也可以與信號探針結合，通過信號探針與目標序列的特異性結合可以用于構建夾層型生物傳感器。

該項目建立了一個簡單、快速的檢測方法實現了對CYP2C19*2的特異、超靈敏檢測。為臨床治療心血管相關疾病提供了個體化用藥的指導方法。

發明內容：