[發明專利]一種用于血清中galectin-3濃度檢測的電化學傳感器制備方法

有效

• 申請號: 201710803421.1
• 申請日: 2017-09-06
• 公開（公告）號: CN107576702B
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 于超;唐志勇;陳俊
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48;G01N33/543;B82Y15/00
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1.一種用于血清中半乳糖凝集素-3濃度檢測的電化學傳感器制備方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)氮摻雜石墨烯納米帶的制備：

稱取0.1g氮摻雜多壁碳納米管加入至10mL的H₂SO₄和H₃PO₄混合溶液中混勻，將混合溶液置于高壓反應釜中在磁力攪拌條件下加熱至140℃持續10min，再將反應混合溶液轉移至65℃油浴中在攪拌條件下加入0.25g高錳酸鉀持續反應8min，反應結束后控制溶液降溫至室溫，所得溶液經10000r/min，離心5min，用超純水清洗3次，將所得沉淀真空干燥24h后，4℃保存備用；

(2)鐵金屬有機框架的制備：

稱取0.187g六水合氯化鐵和0.126g 2-氨基對苯二甲酸加入15mL的二甲基甲酰胺溶液中，混勻，將混合溶液置于120℃硅油中加熱4h，在開始加熱后第15min時，向混合溶液中加入200μL的冰醋酸，加熱結束后控制溶液降溫至室溫，所得溶液經10000r/min，離心5min，將離心所得沉淀分別用DMF，無水乙醇，超純水各清洗3次，最后將所得沉淀真空干燥24h后，4℃保存備用；

(3)鐵金屬有機框架@金納米顆粒復合材料的制備：

取2mL,1％的四水合氯金酸溶液加入到制備好的2mL,1mg mL^-1的鐵金屬有機框架溶液中，劇烈超聲30分鐘后，向上述溶液中逐滴緩慢加入4mL,0.1M的硼氫化鈉溶液，同時放在磁力攪拌器上進行攪拌反應30min，所得溶液經10000r/min，離心5min，用超純水清洗3次，將所得沉淀再分散至4mL的去離子水中，4℃保存備用；

(4)氮摻雜石墨烯納米帶-鐵金屬有機框架@金納米顆粒復合材料的制備：

稱取0.2mg氮摻雜石墨烯納米帶超聲溶解于2mL的去離子水中，將其與4mL制備好的鐵金屬有機框架@金納米顆粒復合物溶液超聲混勻30min，在磁力攪拌500r/min條件下，攪拌過夜，所得溶液經8000r/min，離心5min，用超純水清洗3次，將所得沉淀再分散至4mL的去離子水中，4℃保存備用；

(5)金鉑-亞甲藍的制備：

分別取600μL,0.1M的鹽酸和6mL,1.14mM的十二烷基三甲基溴化銨加入至1mL,9.8mM的亞甲藍溶液中，劇烈攪拌10min，然后加入100μL,4wt％的氯金酸溶液和100μL,4wt％的氯鉑酸溶液，持續室溫攪拌6h，所得溶液經8000r/min，離心10min，用超純水清洗3次，將所得沉淀再分散至2mL,0.1M,pH 7.0的PBS緩沖溶液中，4℃保存備用；

(6)金鉑-亞甲藍-第二抗體的制備：

取100μL半乳糖凝集素-3特異性檢測第二抗體加入至2mL金鉑-亞甲藍納米復合材料溶液中，在4℃條件下溫和攪拌，持續12h，加入40μL,1wt％的牛血清白蛋白在4℃條件下持續溫和攪拌6h，所得溶液經8000r/min，離心10min，將所得沉淀再分散至2mL,0.1M,pH 7.0的PBS緩沖溶液中，4℃保存備用；

(7)建立電化學傳感器：

a、分別用0.3和0.05μm的氧化鋁粉末將電極拋光成鏡面，然后分別按超純水、無水乙醇、超純水的順序超聲電極各5min，室溫干燥備用；

b、將6μL所制備的氮摻雜石墨烯納米帶-鐵金屬有機框架@金納米顆粒復合材料溶液滴加在電極表面，室溫干燥；

c、滴加6μL半乳糖凝集素-3特異性捕獲第一抗體溶液至被修飾的電極表面，4℃孵育12h；

d、用雙蒸水將孵育后的電極沖洗干凈，在電極表面滴加6μL，1wt％的BSA，室溫封閉30min；

e、將上述BSA封閉后的電極用含有10mM Na₂HPO₄,2mM KH₂PO₄,37mM NaCl,2.7mM KCl,pH7.4的清洗緩沖液沖洗干凈并在氮氣中干燥。

2.依據權利要求1所述的制備方法獲得的傳感器實現的半乳糖凝集素-3的定量檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)將6μL不同濃度的目標半乳糖凝集素-3滴加至電極表面，37℃孵育1h用清洗緩沖液沖洗干凈并在氮氣中干燥；

(2)在干燥后電極表面滴加10μL所制備的金鉑-亞甲藍-第二抗體溶液，37℃孵育1h用清洗緩沖液沖洗干凈并在氮氣中干燥；

(3)將電極置于5mL,0.1M,pH 7.0的PBS中進行表征,測量其電流變化電流響應峰值；

(4)根據所得電流變化電流響應峰值與半乳糖凝集素-3濃度呈線性關系，繪制工作曲線。