[發(fā)明專利]HIV病毒潛伏庫雙靶向性嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2017-09-07
• 公開（公告）號: CN107619820A
• 公開（公告）日: 2018-01-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 況軼群;吳光耀;洪琛
• 申請（專利權(quán)）人: 河南大學(xué)淮河醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/62;A61K35/17;A61P31/18
• 代理公司: 鄭州中原專利事務(wù)所有限公司41109
• 代理人: 張春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種HIV病毒潛伏庫雙靶向性嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

抗病毒藥物的聯(lián)合使用（combination anti-retroviral therapy, cART）組成的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（highly active anti-retroviral therapy, HAART）可以有效控制HIV-1感染者或者艾滋病患者體內(nèi)病毒復(fù)制，甚至達(dá)到不可檢測的水平，從而限制AIDS疾病進程。然而，除了cART藥物在長期使用中的毒性和高成本，其最大的局限性在于它不能靶向或清除患者體內(nèi)靜息CD4⁺ T細(xì)胞中存在的潛伏HIV-1病毒。這些潛伏感染的細(xì)胞是非常穩(wěn)定的，因此在體內(nèi)持續(xù)，甚至在長期抑制治療后，通過使用cART藥物后反彈，這構(gòu)成了HIV/AIDS治愈的主要障礙。在治療后不久，病毒載量在大多數(shù)患者中恢復(fù)到治療前水平。HIV-1病毒在宿主體內(nèi)通過整合機制，在靶細(xì)胞中建立穩(wěn)定的長期潛伏感染。如何徹底清除病人體內(nèi)的HIV-1病毒，是治愈AIDS病人的關(guān)鍵問題。

研究表明，CD4⁺中心記憶T細(xì)胞（central memory T cell，Tcm）細(xì)胞占所有潛伏庫細(xì)胞總數(shù)的95%。無法清除儲藏庫的一個原因，是無法精確定位儲藏庫細(xì)胞，本質(zhì)是不知道儲藏庫細(xì)胞的生物標(biāo)志物（biomarker）。之前報道的無論在外周還是淋巴結(jié)或腸道上，檢查點（checkpoint）分子可能是一種潛在的biomarker引起了科學(xué)界很大熱情。Chomont小組在PLoS Pathogens報道了檢查點分子組合與儲藏庫細(xì)胞的關(guān)系，該研究結(jié)果非常直觀而重要。通過研究七種檢查點分子，包括PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIGIT, TIM-3, CD160和B24與儲藏庫細(xì)胞的total DNA, 2-LTR, CA-RNA的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)：CD4細(xì)胞的PD-1, TIGIT, LAG-3表達(dá)與儲藏HIV DNA細(xì)胞正相關(guān)；進一步，這三種分子與不同HIV感染的記憶CD4亞群均呈現(xiàn)正相關(guān)。同時表達(dá)三種分子的CD4儲藏HIV整合DNA的概率較一般CD4高8.2倍；更重要的是，能夠被誘導(dǎo)表達(dá)的、整合有病毒DNA的儲藏庫細(xì)胞表達(dá)至少一種上述三種之一的checkpoint分子。基于上述結(jié)果，使用checkpoint blocker如PD-1單抗將可以直接靶向儲藏庫細(xì)胞。

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor, CAR）修飾的T細(xì)胞免疫療法是當(dāng)前過繼性細(xì)胞治療技術(shù)中最新技術(shù)之一，實現(xiàn)了從基礎(chǔ)免疫學(xué)機制研究到臨床免疫治療應(yīng)用的進步。近年來，應(yīng)用CAR-T技術(shù)治療腫瘤取得了突破性進展，特別是靶向CD19識別B細(xì)胞的CAR-T技術(shù)，在治療急性和慢性白血病方面取得了很好的效果。因此，基因修飾的T細(xì)胞，有可能成為清除HIV-1病毒潛伏庫的重要途徑。研究CAR-T細(xì)胞在清除病毒潛伏庫中的作用和闡明相關(guān)機制，具有重要的基礎(chǔ)研究意義和臨床應(yīng)用價值。

自上世紀(jì)90年代開始，基因修飾T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移（adoptive cell transfer）治療晚期AIDS病人的研究就已開始。為了實現(xiàn)從患者中完全根除HIV，必須從體內(nèi)消除所有HIV-1病毒潛伏庫，包括潛伏性感染的靜息CD4⁺ T細(xì)胞。在T細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域，CAR-T通過將抗體或配體的病毒或腫瘤抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與CD3ζ或其他受體的激活信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域直接連接而產(chǎn)生。以前，HIV-1 Env特異性，嵌合的CD4-CD3ζ（第一代）受體表達(dá)的修飾T細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)在體外有效地靶向和殺死HIV感染的或HIV-1 Env表達(dá)的細(xì)胞。然而，在體內(nèi)，第一代CAR分子隨后在I期和II期臨床試驗中測試沒有成功。早在20年前科學(xué)家們已嘗試將CAR-T 用于HIV感染治療中，Scholler等對1998-2005年3項臨床試驗的患者隨訪發(fā)現(xiàn)，表達(dá)CD4ζCAR的自體CD4⁺和CD8⁺ T淋巴細(xì)胞在HIV感染者體內(nèi)可穩(wěn)定存活至少11年，顯示出CAR-T在HIV感染細(xì)胞治療領(lǐng)域的強大潛力。HIV Env 特異性地表達(dá)CD4-CD3ζ嵌合受體的T細(xì)胞在體外試驗中可有效殺死HIV 感染細(xì)胞或表達(dá)HIV-1 Env蛋白的細(xì)胞，但這種第一代CAR-T在隨后的I期和II 期臨床試驗中并未獲得成功。