[發明專利]HIV病毒潛伏庫雙靶向性嵌合抗原受體修飾的T細胞及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201710801919.4
• 申請日: 2017-09-07
• 公開（公告）號: CN107619820A
• 公開（公告）日: 2018-01-23
• 發明（設計）人: 況軼群;吳光耀;洪琛
• 申請（專利權）人: 河南大學淮河醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/62;A61K35/17;A61P31/18
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司41109
• 代理人: 張春

1.HIV病毒潛伏庫雙靶向性嵌合抗原受體修飾的T細胞，其特征在于：該細胞是HIV病毒潛伏庫雙靶向性嵌合抗原受體biCAR-HC2修飾的T細胞，所述HIV病毒潛伏庫雙靶向性嵌合抗原受體biCAR-HC2由Ibalizumab scFv、VRC01 scFv、CD8α的鉸鏈區和跨膜區、4-1BB的胞內信號結構域和CD3ζ的胞內信號結構域串聯構成，scFv的V_H和V_L之間通過(G4S)×3 Linker連接，不同scFv之間通過(G4S)×5 Linker連接。

2. 如權利要求1所述的HIV病毒潛伏庫雙靶向性嵌合抗原受體修飾的T細胞，其特征在于：所述HIV病毒潛伏庫雙靶向性嵌合抗原受體biCAR-HC2的核苷酸序列如序列表SEQID NO. 1所示。

3. 一種如權利要求1所述的T細胞的制備方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：將通過全基因技術合成的Ibalizumab scFv、VRC01 scFv、CD8α的鉸鏈區和跨膜區、4-1BB的胞內信號結構域和CD3ζ的胞內信號結構域按照順序串聯后，連接到載體pCDH上，包裝成攜帶嵌合抗原受體biCAR-HC2編碼基因的慢病毒，利用該慢病毒感染T細胞，使T細胞表達該嵌合抗原受體biCAR-HC2。

4.一種如權利要求3所述的T細胞的制備方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：

（1）T細胞的制備：人T淋巴細胞系Jurkat于RPMI 1640培養基培養，加入10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml硫酸鏈霉素；外周血單核細胞通過Ficoll淋巴細胞分離液分離，細胞在GT-T551培養基中培養，并加入rhIL-2至終濃度為100 IU/mL，按照培養基體積加入5% 自體血清；淋巴細胞的激活擴增：在淋巴細胞培養基中加入MACS GMP TransAct CD3/CD28 Kit (100:1)；37℃，5% CO₂條件下培養24 h后準備感染；

（2）嵌合抗原受體pCDH-biCAR-HC2的構建：將通過全基因技術合成的Ibalizumab scFv、VRC01 scFv、CD8α的鉸鏈區和跨膜區、4-1BB的胞內信號結構域和CD3ζ的胞內信號結構域按照順序串聯后，克隆至pUC57-Amp載體上，通過限制性內切酶Xba I和Not I雙酶切pUC57-Amp-biCAR-HC2和pCDH目的載體，回收biCAR-HC2片段和pCDH載體；通過T4 DNA ligase連接目的片段和載體，轉化Stbl 2感受態細胞；挑取單克隆菌落測序鑒定，鑒定正確的慢病毒表達質粒即為嵌合抗原受體pCDH-biCAR-HC2；

（3）病毒濃縮液的制備：慢病毒表達質粒pCDH-biCAR-HC2與輔助質粒pMD.2G、psPAX按5:2:4的質量比共轉染HEK293T細胞，48h后收集病毒上清液，濾膜過濾病毒上清液，再濾液中添加1/4體積的病毒濃縮液Lenti-X concentrator進行混勻，離心后棄上清，沉淀用DMEM培養液溶解，獲得病毒濃縮液；

（4）嵌合抗原受體biCAR-HC2修飾T細胞：將Jurkat細胞與從用病毒轉導促進劑Retronectin包被的6孔板中的載體產生細胞中收獲的培養上清液混合，離心除去培養物上清液，培養箱中培養過夜；第二天，第二次轉導細胞以增加轉導效率；除去培養物上清液，培養箱中培養，獲得嵌合抗原受體biCAR-HC2修飾的T細胞，該嵌合抗原受體biCAR-HC2的成熟蛋白氨基酸序列如序列表中SEQID NO. 2所示。

5.一種HIV病毒潛伏庫雙靶向性嵌合抗原受體修飾的T細胞，其特征在于：該細胞是采用權利要求3或4所述的方法制備的。

6.權利要求1或5所述的HIV病毒潛伏庫雙靶向性嵌合抗原受體修飾的T細胞在制備用于清除HIV-1病毒潛伏庫制劑中的應用。