[發(fā)明專利]一種c-Myc蛋白可結(jié)合DNA片段及在c-Myc活性檢測(cè)中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710801572.3
• 申請(qǐng)日: 2017-09-07
• 公開（公告）號(hào): CN107460192B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 童強(qiáng)松;鄭麗端;洪梅;王建群;肖文晶;葉霖;李聃;楊楓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12N15/85;C12Q1/66
• 代理公司: 武漢泰山北斗專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42250
• 代理人: 程千慧

本發(fā)明涉及一種c?Myc蛋白可結(jié)合的DNA片段，其包含一個(gè)或多個(gè)c?Myc蛋白結(jié)合框，每個(gè)c?Myc蛋白結(jié)合框的序列為5'?SCACGTGS?3'，S表示C或G；還涉及該DNA片段的應(yīng)用；還涉及一種用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)c?Myc蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的方法。通過使用本發(fā)明的DNA片段和方法，可直接針對(duì)性地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)c?Myc蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，而非僅僅檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄本或蛋白質(zhì)的含量，從而使得能夠更準(zhǔn)確地分析c?Myc蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子在一些疾病發(fā)展中所起的作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更特別地，涉及一種c-Myc蛋白可結(jié)合的DNA片段及其在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)c-Myc轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

c-Myc是細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Myc家族成員之一，能調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞代謝重編程。c-Myc基因定位于染色體8q24，主要通過擴(kuò)增和染色體易位重排的方式激活，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和演變轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。c-Myc基因在人類粒細(xì)胞性白血病、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、成骨肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤等腫瘤組織中擴(kuò)增和過度表達(dá)，與腫瘤的早期復(fù)發(fā)有關(guān)。

c-Myc蛋白在結(jié)構(gòu)上可分為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)、非特異DNA結(jié)合區(qū)、核定位序列、堿性區(qū)、螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)及亮氨酸拉鏈區(qū)。c-Myc蛋白HLH區(qū)緊隨著堿性區(qū)，當(dāng)該堿性區(qū)以特殊方式結(jié)合至DNA上時(shí)，可變成螺旋結(jié)構(gòu)，c-Myc蛋白發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用。

目前檢測(cè)c-Myc有多種方法，western blot或qPCR等方法雖然靈敏度高，但檢測(cè)到的只是c-Myc蛋白含量的差異，不能體現(xiàn)出c-Myc結(jié)合其特異靶序列后活性的改變情況。

因此，需要一種簡(jiǎn)單可靠的檢測(cè)內(nèi)源性c-Myc轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的方法。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，c-Myc蛋白結(jié)合的DNA序列存在高度的保守性，其結(jié)合的DNA核心序列為5'-SCACGTGS-3'(S表示C或G)。

基于以上研究，本發(fā)明提供了一種c-Myc蛋白可結(jié)合的DNA片段，其包含一個(gè)或多個(gè)c-Myc蛋白結(jié)合框，每個(gè)所述c-Myc蛋白結(jié)合框的序列獨(dú)立地為5'-SCACGTGS-3'，S表示C或G。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)包含多個(gè)c-Myc蛋白結(jié)合框時(shí)，每?jī)蓚€(gè)相鄰的c-Myc蛋白結(jié)合框之間具有間隔序列，并且每?jī)蓚€(gè)相鄰的c-Myc蛋白結(jié)合框之間的所述間隔序列為AT。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明還提供了上述DNA片段在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)c-Myc轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)c-Myc轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的方法，其包括以下步驟：

S1：將包括上述DNA片段以及連接于所述DNA片段下游的報(bào)告基因表達(dá)框的報(bào)告基因系統(tǒng)導(dǎo)入所述細(xì)胞；

S2：通過檢測(cè)所述報(bào)告基因的表達(dá)來計(jì)算所述細(xì)胞內(nèi)c-Myc轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述報(bào)告基因系統(tǒng)為雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，包括重組質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒，并且所述重組質(zhì)粒帶有所述DNA片段以及連接在所述DNA片段下游的熒光素酶I的表達(dá)框，所述對(duì)照質(zhì)粒帶有熒光素酶II的表達(dá)框，所示熒光素酶I與所述熒光素酶II不同。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組質(zhì)粒通過將所述DNA片段插入至質(zhì)粒pGL3-Basic的Kpn I與Hind III位點(diǎn)之間得到。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述對(duì)照質(zhì)粒為phRL-TK。

在一個(gè)實(shí)施方案中，S1具體包括：

S11：將所述細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁，并恢復(fù)形態(tài)；