[發明專利]一種火麻仁蛋白水解物抗氧化活性的研究方法

在審

• 申請號: 201710795074.2
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN107703079A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 薛峰;李璇;王身艷;王娟紅;孫鈺峰;陳昌暘
• 申請（專利權）人: 南京中醫藥大學
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33
• 代理公司: 南京禾易知識產權代理有限公司32320
• 代理人: 仇波

1.一種火麻仁蛋白水解物抗氧化活性的研究方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)火麻仁的脫脂；(2)火麻仁蛋白的制備；(3)高溫和超聲波的預處理；(4)酶解經高溫和超聲波預處理的蛋白樣品；(5)清除DPPH自由基的能力；(6)總還原力測定；(7)清除羥基自由基HO·能力；(8)金屬離子螯合能力的測定；(9)ABTS陽離子自由基清除法測定；(10)統計分析。

2.根據權利要求1所述的一種火麻仁蛋白水解物抗氧化活性的研究方法，其特征在于：火麻仁的脫脂包括以下步驟，選取市售去殼火麻仁，將火麻仁置于干燥箱中60攝氏度干燥4小時，接著用粉碎機粉碎，過60目篩，過篩后的原料加入石油醚，機械攪拌2小時脫脂，離心收集沉淀備用，石油醚采用旋轉蒸發儀回收。

3.根據權利要求1所述的一種火麻仁蛋白水解物抗氧化活性的研究方法，其特征在于：火麻仁蛋白的制備包括以下步驟，將脂后的火麻仁原料粉以1:10固液比分散在去離子水中，常溫攪拌1小時后，攪拌的過程中不斷加入1mol/L氫氧化鈉調節pH至8.5，用離心機4000rpm/min離心20min后分離去除沉淀，將所得溶液用1mol/L鹽酸調pH4.5，靜置5min后，用離心機4000rpm/min離心20min后分離出酸沉蛋白，用去離子水洗滌2次，使其在水中形成蛋白分散液，再用1mol/L氫氧化鈉調pH值至7.0，將所得酸沉蛋白分散液經冷凍干燥后即為火麻仁蛋白。

4.根據權利要求1所述的一種火麻仁蛋白水解物抗氧化活性的研究方法，其特征在于：高溫和超聲波的預處理包括以下步驟，將火麻仁蛋白分散在磷酸鹽緩沖溶液中配制成1％的蛋白溶液，攪拌使火麻仁蛋白完全溶解，然后使用超聲波細胞粉碎機對溶液進行處理，設置超聲強度分別為200w、400w、600w，超聲時間均為20min，超聲開時間2s，超聲關時間1s，此外設置一個對照樣本，常壓下高溫預處理，配制5％的蛋白溶液100℃水浴加熱30min，然后冷卻到室溫，高溫和超聲波預處理的樣品均凍干并儲存于干燥器中。

5.根據權利要求1所述的一種火麻仁蛋白水解物抗氧化活性的研究方法，其特征在于：酶解經高溫和超聲波預處理的蛋白樣品包括以下步驟，定量稱取蛋白質后用蒸餾水配制成5％的蛋白溶液，用0.5mol/L的氫氧化鈉將其pH值調節到9.0，用50℃水浴加熱，再加入堿性蛋白酶酶解，此過程中使用0.5mol/L氫氧化鈉溶液和0.1mol/L鹽酸溶液控制酶解液恒定的pH值，酶解6小時后反應結束，酶解物在100℃水中煮沸15min以使酶失活，冷卻至室溫，用1mol/L鹽酸溶液調pH為4.5，然后用離心機4000r/min離心20min，收集上清液凍干備用。

6.根據權利要求1所述的一種火麻仁蛋白水解物抗氧化活性的研究方法，其特征在于：清除DPPH自由基的能力包括以下步驟，取0.3mL不同濃度的樣品溶液添加到2.7mL0.0001mol/LDPPH新鮮配制的乙醇溶液中，用力混合均勻，反應混合物在室溫黑暗中放置30min后，用紫外-可見分光光度計在517nm測定吸光度，用沒有加樣品的DPPH乙醇溶液作為空白對照，抑制率可用以下公式表示：

式中：A_t＝0代表空白的吸光度；

A_t＝30min代表加入水解液后保溫30min的吸光度。

7.根據權利要求1所述的一種火麻仁蛋白水解物抗氧化活性的研究方法，其特征在于：總還原力測定包括以下步驟，取1mL樣品溶液分別與2.5mL磷酸緩沖液和2.5mL鐵氰化鉀溶液混合，混合物在50℃保溫20min，然后加入2.5mL10％三氯乙酸，用離心機在3000r/min離心10min，離心結束后吸取2mL上清液于試管中，再加入2.5mL蒸餾水和0.5mL氯化鐵，混合均勻，用蒸餾水做參照，紫外分光光度計在700nm測定其分光光度值，高的吸光度表示強的還原力。