[發明專利]一種鑒定煙草中蛋白與蛋白組的多維液相色譜質譜聯用法

有效

• 申請號: 201710793611.X
• 申請日: 2017-09-06
• 公開（公告）號: CN107607642B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 陳敏;董惠忠;吳達
• 申請（專利權）人: 上海煙草集團有限責任公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/46;G01N30/72;G01N30/89
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 許亦琳

本發明提供一種鑒定煙草中蛋白與蛋白組的多維液相色譜質譜聯用法，具體包括以下步驟：1）將煙葉樣品，采用三氯乙酸?丙酮沉淀法、苯酚法分別提取蛋白，再將蛋白合并后復溶，獲得蛋白樣品溶液；2）將蛋白樣品溶液進行酶解、脫鹽、干燥，獲得肽段干粉作為試樣；3）將制備的試樣依次通過第一維液相色譜、第二維液相色譜進行捕集后洗脫分離，再由質譜進行檢測。本發明提供的該種方法，最大程度保留樣本中的蛋白，大大提高了色譜的峰容量，具有檢測通量高、靈敏度高，鑒定出的蛋白組量多的優點。

技術領域

本發明屬于煙草蛋白與蛋白組研究技術領域，涉及一種鑒定煙草中蛋白與蛋白組的多維液相色譜質譜聯用法，具體涉及一種提取、酶解、測定新鮮煙葉中蛋白與蛋白組多維液相色譜質譜聯用法。

背景技術

隨著各種檢測技術發展，蛋白質組的概念于1994年被提出，它是后基因組時代功能基因組學研究的新興學科和熱點領域。蛋白質組學是從整體、動態、網絡的水平上對蛋白質進行研究，研究蛋白質組是研究認識復雜生命活動的要求。

煙草(Nicotiana tabacum)是重要的經濟作物，同時作為復雜的模式植物，煙草在植物遺傳、發育、生理、生化和轉基因等領域的研究中有代表性，因此開展煙草蛋白組學研究具有重要意義。

目前，檢測煙草中蛋白與蛋白組的方法具有檢測通量低、鑒定出的蛋白組量少等缺陷，因此有必要對現有技術進行進一步的研究與探討，尋找一種更好的提取、鑒定煙草中蛋白與蛋白組的方法。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種鑒定煙草中蛋白與蛋白組的多維液相色譜質譜聯用法，用于解決現有技術中缺乏檢測通量高、靈敏度高、鑒定出的蛋白組量多的鑒定煙草中蛋白與蛋白組的方法的問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供一種鑒定煙草中蛋白與蛋白組的多維液相色譜質譜聯用法，具體包括以下步驟：

1)將煙葉樣品，采用三氯乙酸-丙酮沉淀法、苯酚法分別提取蛋白，再將蛋白合并后復溶，獲得蛋白樣品溶液；

2)將步驟1)所得蛋白樣品溶液進行酶解、脫鹽、干燥，獲得肽段干粉作為試樣；

3)將步驟2)中制備的試樣進行二維液相色譜質譜聯用法檢測，依次通過第一維液相色譜、第二維液相色譜進行捕集后洗脫分離，再由質譜進行檢測。

優選地，步驟1)中，所述三氯乙酸-丙酮沉淀法為常規用于提取蛋白的三氯乙酸(TCA)-丙酮沉淀法。具體來說，所述三氯乙酸-丙酮沉淀法為根據《Sample extractiontechniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues》(Isaacson T；Damasceno CM；Saravanan RS；He Y；CataláC；SaladiéM；Rose JK，Nature Protocols，2006，1，769-774)記載的三氯乙酸(TCA)-丙酮沉淀法。

優選地，步驟1)中，所述苯酚法為常規用于提取蛋白的苯酚法。具體來說，所述苯酚法為根據《Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis ofplant tissues》(Isaacson T；Damasceno CM；Saravanan RS；He Y；CataláC；SaladiéM；Rose JK，Nature Protocols，2006，1，769-774)記載的苯酚法進行提取蛋白。

優選地，步驟1)中，所述復溶采用的溶劑為4-8M(mol/L)尿素水溶液。更優選地，所述溶劑為6M(mol/L)尿素水溶液。