[發明專利]一種鑒定煙草中蛋白與蛋白組的多維液相色譜質譜聯用法

有效

• 申請號: 201710793611.X
• 申請日: 2017-09-06
• 公開（公告）號: CN107607642B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 陳敏;董惠忠;吳達
• 申請（專利權）人: 上海煙草集團有限責任公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/46;G01N30/72;G01N30/89
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 許亦琳

1.一種鑒定煙草中蛋白與蛋白組的多維液相色譜質譜聯用法，具體包括以下步驟：

1)將煙葉樣品，采用三氯乙酸-丙酮沉淀法、苯酚法分別提取蛋白，再將蛋白合并后復溶，獲得蛋白樣品溶液；

2)將步驟1)所得蛋白樣品溶液進行酶解、脫鹽、干燥，獲得肽段干粉作為試樣；

3)將步驟2)中制備的試樣進行二維液相色譜質譜聯用法檢測，依次通過第一維液相色譜、第二維液相色譜進行捕集后洗脫分離，再由質譜進行檢測；

所述復溶采用的溶劑為4-8M尿素水溶液；所述蛋白樣品溶液中，所述復溶采用的溶劑加入的體積與蛋白的質量之比為55-65：1，μl/mg；

步驟2)中，所述酶解過程為：取蛋白樣品溶液，依次加入二硫蘇糖醇溶液、碘乙酰胺溶液進行反應后，轉移至超濾管中加入碳酸氫銨溶液進行超濾離心，再加入胰蛋白酶進行反應后補加胰蛋白酶繼續反應，將反應產物離心后，收集獲得肽段溶液；

步驟2)中，所述脫鹽是將酶解后獲得的肽段溶液過C18固相萃取柱進行脫鹽；所述干燥為凍干，所述凍干的溫度為≤-80℃；

步驟3)中，所述第一維液相色譜的條件為：第一維液相色譜系統：Aquity UPLC系統；第一維肽段捕集柱：Acclaim PepMap C18捕集柱；第一維液相色譜柱：XBridge反相液相色譜柱；柱溫：室溫；流速：150-250μl/min；進樣量：5-20μl；第一維流動相A相：15-25mM甲酸銨水溶液，pH＝9-11；第一維流動相B相：15-25mM甲酸銨+85-95v/v％乙腈水溶液，pH＝9-11；檢測波長：210-220nm；梯度洗脫；

所述第一維液相色譜的梯度洗脫的具體程序為：

0-40min，A相：B相體積比為95：5-65：35；

40-41min，A相：B相體積比為65：35-95：5；

41-56min，A相：B相體積比為95：5-95：5；

步驟3)中，所述第二維液相色譜的條件為：第二維液相色譜系統：Nano Aquity UPLC系統；第二維肽段捕集柱：Acclaim PepMap C18捕集柱；第二維液相色譜柱：Acclaim PepMapC18納升級反相色譜柱；上樣流速：5-15μl/min；上樣時間：2-4min；進樣量：6-10μl；柱溫：35-45℃；流速：250-350nL/min；第二維流動相A相：4-6v/v％乙腈+0.05-0.15v/v％甲酸水溶液，pH＝2-3；第二維流動相B相：85-95v/v％乙腈+0.05-0.15v/v％甲酸水溶液，pH＝2-3；梯度洗脫；

所述第二維液相色譜的梯度洗脫的具體程序為：

0-45min，A相：B相體積比為98：2-60：40；

45-45min，A相：B相體積比為60：40-98：2；

45-60min，A相：B相體積比為98：2-98：2。

2.根據權利要求1所述的一種鑒定煙草中蛋白與蛋白組的多維液相色譜質譜聯用法，其特征在于，步驟1)中，所述蛋白樣品溶液采用紫外分光光度法進行定量，包括以下步驟：

A)將蛋白樣品溶液，加入沉淀劑進行旋轉混懸后離心，取沉淀物加入溶解劑進行旋轉混懸后溶解，再加入顯色劑混合后，進行孵育反應，即得待測樣品溶液；

B)取一系列不同濃度的蛋白標準溶液，采用與步驟A)相同的處理過程，即得一系列不同濃度的待測標準溶液；

C)將步驟A)中獲得的待測樣品溶液和步驟B)中獲得的待測標準溶液，添加入試劑盒，采用紫外分光光度法進行吸光度測定，采用標準曲線法進行定量，獲得蛋白樣品溶液中蛋白的含量。

3.根據權利要求2所述的一種鑒定煙草中蛋白與蛋白組的多維液相色譜質譜聯用法，其特征在于，步驟A)中，包括以下條件中任一項或多項：

A1)所述沉淀劑為預冷后的三氯乙酸-丙酮溶液，所述三氯乙酸-丙酮溶液的預冷溫度不大于5℃；

A2)所述溶解劑包括有溶解液和水，所述溶解液、水與所述蛋白樣品溶液加入的體積之比為9-11:39-41:1；所述溶解液為含有0.05-0.2wt％十二烷基硫酸鈉的4-8M尿素水溶液；

A3)所述顯色劑為BCA蛋白定量試劑盒中配備的顯色劑。