[發(fā)明專利]一種快速檢測(cè)土壤中病原微生物的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710793525.9
• 申請(qǐng)日: 2017-09-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107447049B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范瑤飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 遵義市精科信檢測(cè)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12R1/94;C12R1/645;C12R1/77
• 代理公司: 重慶強(qiáng)大凱創(chuàng)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50217
• 代理人: 向林

本發(fā)明涉及環(huán)境微生物及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)土壤中病原微生物存在的方法。本發(fā)明方法包括環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增引物的獲得、DNA的提取和擴(kuò)增、所檢測(cè)微生物的種類的判定。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了對(duì)土傳病原微生物的高效、快速、定性檢測(cè)，無(wú)需PCR擴(kuò)增即可通過(guò)肉眼判斷靶標(biāo)微生物的存在。本發(fā)明適用于環(huán)境檢測(cè)、食品檢測(cè)、病原菌檢測(cè)等領(lǐng)域。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及環(huán)境檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地涉及土壤微生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別地涉及一種快速檢測(cè)土壤中病原微生物的方法。

背景技術(shù)

土壤中存在數(shù)量巨大、種類繁多的微生物，它們中的絕大部分是有益的，在土壤發(fā)育、物質(zhì)轉(zhuǎn)化、結(jié)構(gòu)形成、提高作物養(yǎng)分有效性、抑制病原菌活性等方面發(fā)揮著不可替代的作用。但是土壤中也存在著另一類引起作物病害的有害微生物，通稱為土傳病原微生物(soil-borne pathogens)。由生活在土壤中或殘留在土壤的病株殘?bào)w中的病菌引起的作物病害統(tǒng)稱為土傳病(soil-borne diseases)。

日前，在節(jié)能溫室中栽培的瓜類、茄果類、豆類等蔬菜上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的病害有100多種，經(jīng)常發(fā)生、危害比較嚴(yán)重的有50余種，在這些病害當(dāng)中，除黃瓜霜霉病等極少數(shù)病害是借助氣流和人們的農(nóng)事活動(dòng)從溫室外面?zhèn)魅胪猓^大多數(shù)真菌性、細(xì)菌性病害和部分病毒性病害，其病菌都是在土壤中或借助病殘?bào)w在土壤中越冬。這些病害的初次侵染，幾乎都是來(lái)自溫室內(nèi)的土壤。

防治土傳病害，必須嚴(yán)格執(zhí)行“以防為主、綜合防治”的植保方針，以減少溫室土壤菌源為首要目的，所以土傳病原菌的快速檢測(cè)及鑒定對(duì)于防治土傳病害有至關(guān)重要的作用。

本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)土壤環(huán)境中土傳病原菌的方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、恒溫、操作簡(jiǎn)單和檢測(cè)結(jié)果快速讀取等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種環(huán)境檢測(cè)方法，包括利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增定性檢測(cè)靶標(biāo)微生物的存在。

進(jìn)一步地，所述微生物為土傳病原微生物，所述土傳病原微生物包括但不限于病毒和細(xì)菌，所述病毒為大麥黃花葉病毒，所述細(xì)菌包括但不限于立枯絲核菌、鐮刀菌、腐霉菌和黃萎輪枝孢菌。

更進(jìn)一步地，所述環(huán)境檢測(cè)方法檢測(cè)環(huán)境中土壤微生物的具體步驟為：

步驟1、提取獲得環(huán)境中土壤微生物總DNA序列；

步驟2、按如下反應(yīng)體系擴(kuò)增土壤微生物總DNA樣品：

雙蒸水補(bǔ)足至20μL；

步驟3、于55℃反應(yīng)3分鐘，之后于95℃反應(yīng)5分鐘，冷卻至常溫，在產(chǎn)物中加入PicoGreen(Invitrogen,Carlsbad,USA)，通過(guò)顏色區(qū)別判斷產(chǎn)物量，陽(yáng)性產(chǎn)物顏色由橙色變?yōu)辄S色，陰性產(chǎn)物則保持黃色不變；

步驟4、所述引物用于檢測(cè)大麥黃花葉病毒、立枯絲核菌、鐮刀菌、腐霉菌以及黃萎輪枝孢菌。

優(yōu)選的，所述產(chǎn)物量可以通過(guò)肉眼觀測(cè)渾濁度判定，如存在靶標(biāo)微生物則反應(yīng)液呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，如不存在靶標(biāo)微生物則反應(yīng)液澄清。

進(jìn)一步地，所述反應(yīng)體系為：

雙蒸水補(bǔ)足至50μL。

優(yōu)選地，所述總DNA樣品包括但不限于大麥黃花葉病毒、立枯絲核菌、鐮刀菌、腐霉菌和黃萎輪枝孢菌的脫氧核糖核苷酸序列。