[發明專利]一種快速檢測土壤中病原微生物的方法

有效

• 申請號: 201710793525.9
• 申請日: 2017-09-06
• 公開（公告）號: CN107447049B
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發明（設計）人: 范瑤飛
• 申請（專利權）人: 遵義市精科信檢測有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12R1/94;C12R1/645;C12R1/77
• 代理公司: 重慶強大凱創專利代理事務所(普通合伙) 50217
• 代理人: 向林

1.一種環境檢測方法，其特征在于，包括利用環介導等溫擴增定性檢測靶標微生物的存在，所述微生物為土傳病原微生物，所述土傳病原微生物為病毒和細菌，所述病毒為大麥黃花葉病毒，所述細菌為立枯絲核菌、腐霉菌和黃萎輪枝孢菌，所述方法包括：

步驟1、提取獲得環境中土壤微生物總DNA序列；

步驟2、按如下反應體系擴增土壤微生物總DNA樣品：

步驟3、于55℃反應3分鐘，之后于95℃反應5分鐘，冷卻至常溫，在產物中加入PicoGreen，通過顏色區別判斷產物量，陽性產物顏色由橙色變為黃色，陰性產物則保持黃色不變；

步驟4、所述引物用于檢測大麥黃花葉病毒、立枯絲核菌、腐霉菌以及黃萎輪枝孢菌，所述引物包括：

大麥黃花葉病毒BYMV：

BYMV-BIP：5-GATTGTCCGTGGCTCTGGCTC-GTCT CAAGGGGCGAATC-3

BYMV-FIP：5-TCCGATACGAGGTGCGGC-GTTT CCCAGAAGGGCTACC-3

BYMV-B3：5-GGCTTTGTCAGGCGATCGTAGC-3

BYMV-F3：5-GCATCGTAGCTCGAAGCTAGCTAG-3

立枯絲核菌Rhi:

Rhi-BIP：5-AATTCGTCCGTAGGAATCGAT-GTGG GTGTCCGTAGCGT-3

Rhi-FIP：5-CAGCGTAGGTTAACGTAC-TTGT AGCTGTCGTCCACAAC-3

Rhi-B3：5-GCGGTGTCAGTATCTAGGATC-3

Rhi-F3：5-TCTAGCGTAGCCGGTAGATCGTACTT-3

腐霉菌Pyt：

Pyt-BIP：5-GCGAATCGACATCGTTAACGTAG-TGGT TCGGAGCCCTAAGAG-3

Pyt-FIP：5-TACTAGGAACTCTCAAATCT-TTGG CGAATCGGGCGTAAGTCG-3

Pyt-B3：5-CCTTGAGAGAATCGTGTACGTGCCTA-3

Pyt-F3：5-TCGGTAACGTAGCAGTAGTCGGTAGC-3

黃萎輪枝孢Ver：

Ver-BIP：5-TGCCAAATCGGTATCAATCCAGACT-TTGG GCTACTCGGTCGAT-3

Ver-FIP：5-GCTACGTCCTAGCTGTTCGTC-GTGG CCCAGTGATTTTGAGTT-3

Ver-B3：5-GTGGTGAAGCCTAGCTAGGTCAGTAG-3

Ver-F3：5-CCTATCATGGGACAGCAGCGGGAC-3

所述方法為一種以土壤為樣本通過LAMP快速檢測技術同時檢測出大麥黃花葉病毒、立枯絲核菌、腐霉菌以及黃萎輪枝孢菌四種土傳病原菌的方法。

2.根據權利要求1所述的環境檢測方法，其特征在于，所述產物量通過肉眼觀測渾濁度判定，如存在陽性產物則反應液呈現渾濁狀態，如不存在陽性產物則反應液澄清。