[發明專利]一種適配體電化學傳感器及用于檢測毒死蜱的方法

在審

• 申請號: 201710791830.4
• 申請日: 2017-09-05
• 公開（公告）號: CN107367540A
• 公開（公告）日: 2017-11-21
• 發明（設計）人: 胥國立;霍丹群;侯長軍;包靜;楊眉
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327
• 代理公司: 重慶博凱知識產權代理有限公司50212
• 代理人: 張先蕓

技術領域

本發明涉及一種檢測殘留農藥的適配體電化學傳感器及制備方法，具體涉及一種適配體電化學傳感器及制備方法，并用于檢測毒死蜱的方法。屬于生物化學技術領域。

背景技術

有機磷殺蟲劑（OP）是世界上最常用的農藥之一，特別是發展中國家，并可以轉化為化學武器中使用的神經毒素。由于其抑制神經系統中乙酰膽堿酯酶（AChE）或膽堿酯酶（ChE）的活性，OP可以破壞正常的神經沖動傳導，引起一系列中毒癥狀，如異常興奮，痙攣，麻痹和死亡。因此，OP正在吸引越來越多的國家為OP的安全應用設定更嚴格的標準。毒死蜱（O，O-二乙基-O-（3,5,6-三氯-2-吡啶基）硫代磷酸酯）是二級毒物，是過去十年來最廣泛使用的廣泛OP之一。從最新報道，毒死蜱也與癌癥，慢性阻塞性肺疾病，哮喘和生殖系統損傷有關。 OPs在土壤和水中的廣泛使用已經導致飲用水和土壤的嚴重污染，并給人類帶來嚴重的健康威脅。

目前，已經有許多分析方法用于測定毒死蜱，如HPLC，GC-MS，連續流動系統，紅外顯微成像，光電化學傳感和薄層色譜。 盡管它們的靈敏度和準確度都很高，但由于成本高，樣品制備復雜，專業操作要求高等缺點，使其使用范圍受限。CN105092850專利公開了利用電化學免疫傳感器來檢測毒死蜱，雖然其基于抗體的檢測技術顯示出高靈敏度和特異性，但抗體的實施仍然面臨許多局限性，如易失活，難以修飾。

適配體是單體DNA或RNA寡核苷酸分子，其在體外化學合成并且能夠以高特異性和親和力結合靶分子。由于隨機寡核苷酸文庫的多樣性，可以通過指數富集（SELEX）對許多靶標（包括重金屬離子，小有機分子）的配體系統演化技術篩選適體。與抗體相比，適體具有易于制備和保存，更加便利的改性和更高的熱穩定性的明顯優點。已經通過電化學，熒光，比色法和表面增強拉曼光譜（SERS）的不同檢測策略，將適配器應用于各種生物傳感器的開發中。由于電化學方法靈敏度高，反應快，容易小型化，是痕量分析的非常有吸引力的選擇。

現今報道的用于毒死蜱檢測的電化學適配體傳感器，但并沒有涉及到適配體傳感器的再生。 單個電極的可重用性是電化學生物傳感器檢測真實樣品的關鍵因素。因此，探索電化學適配體傳感器及其再生是至關重要的。

發明內容

針對現有技術存在的上述不足，本發明的目的是提供一種適配體電化學傳感器及制備方法，解決生物傳感器的傳感信號檢測限高，選擇性差，不易再生的問題。

進一步，本發明還提供所述適配體電化學傳感器用于檢測毒死蜱的方法，實現對低濃度毒死蜱有機磷農藥定性和定量檢測。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種適配體電化學傳感器，采用三電極系統，以玻碳電極作為基體，所述三電極系統以生物傳感器作為工作電極，Ag/AgCl和3M KCl作為參比電極，鉑絲電極作為輔助電極；所述基體表面上從外到內依次包括第一檢測層、第二檢測層和固定層；所述第一檢測層包括適配體和其部分互補鏈的氨基修飾捕獲探針，所述第二檢測層包括氧化銅納米花和單壁碳納米管，所述固定層為nafion，所述第一檢測層、第二檢測層通過探針的氨基和單壁碳納米管上的羧基脫水縮合反應連接。

進一步，所述適配體具有如SEQ ID NO. 1 所示核苷酸序列。

一種適配體電化學傳感器的制備方法，包括以下步驟：

（1）氧化銅納米花溶液的制備：稱量CuSO₄·5H₂O，在燒杯中配制0.04M CuSO4 的水溶液，在80℃下連續攪拌2h，將0.2M NaOH溶液逐滴加入到上述CuSO4溶液中，形成黑色沉淀，在連續攪拌20min后，將沉淀物在室溫下自然冷卻，然后將沉淀物置于水洗滌，10,000rpm離心4min收集沉淀，再將沉淀物置于無水乙醇中洗滌10,000rpm離心2min,收集沉淀， 最后將沉淀氧化銅納米花（CuO NFs）在真空烘箱中干燥，將CuO NFs在乙醇中懸浮終濃度為2-4mg/mL，所述CuSO4和NaOH的體積比為1:0.7-1:1；

（2）單壁碳納米管溶液的配制：將羧基功能化的單壁碳納米管溶于N,N-二甲基甲酰胺中，二者的質量體積比為1:2-1:1,并超聲分散30-60min,得到終濃度為0.5-1mg/mL的單壁碳納米管溶液；