[發明專利]一種適配體電化學傳感器及用于檢測毒死蜱的方法

在審

• 申請號: 201710791830.4
• 申請日: 2017-09-05
• 公開（公告）號: CN107367540A
• 公開（公告）日: 2017-11-21
• 發明（設計）人: 胥國立;霍丹群;侯長軍;包靜;楊眉
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327
• 代理公司: 重慶博凱知識產權代理有限公司50212
• 代理人: 張先蕓

1.一種適配體電化學傳感器，采用三電極系統，以玻碳電極作為基體，其特征在于，所述三電極系統以生物傳感器作為工作電極，Ag/AgCl和3M KCl作為參比電極，鉑絲電極作為輔助電極；所述基體表面上從外到內依次包括第一檢測層、第二檢測層和固定層；所述第一檢測層包括適配體和其部分互補鏈的氨基修飾捕獲探針，所述第二檢測層包括氧化銅納米花和單壁碳納米管，所述固定層為nafion，所述第一檢測層、第二檢測層通過探針的氨基和單壁碳納米管上的羧基脫水縮合反應連接。

2.根據權利要求1所述適配體電化學傳感器，其特征在于，所述適配體具有如SEQ ID NO. 1 所示核苷酸序列。

3.一種適配體電化學傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）氧化銅納米花溶液的制備：稱量CuSO₄·5H₂O，在燒杯中配制0.04M CuSO₄ 的水溶液，在80℃下連續攪拌2h，將0.2M NaOH溶液逐滴加入到上述CuSO₄溶液中，形成黑色沉淀，在連續攪拌20min后，將沉淀物在室溫下自然冷卻，然后將沉淀物置于水洗滌，10,000rpm離心4min收集沉淀，再將沉淀物置于無水乙醇中洗滌10,000rpm離心2min，收集沉淀，最后將沉淀氧化銅納米花（CuO NFs）在真空烘箱中干燥，將干燥后的CuO NFs在乙醇中懸浮終濃度為2-4mg/mL，所述CuSO4溶液和NaOH溶液的體積比為1:0.7-1:1；

（2）單壁碳納米管溶液的配制：將羧基功能化的單壁碳納米管溶于N,N-二甲基甲酰胺中，二者的質量體積比為1:1-1:2，并超聲分散30-60min，得到終濃度為0.5-1mg/mL的單壁碳納米管溶液；

（3）基底電極的處理：將玻碳電極用0.3μm，0.5μm的三氧化二鋁粉依次進行拋光，然后用去離子水沖洗，并在乙醇或水中超聲5min，電極晾干后，取5ul 0.05%（wt%）的nafion滴加到玻碳電極表面，室溫晾干，再將步驟(1)和(2)獲得的溶液混合均勻，取5-10μL的氧化銅納米花-單壁碳納米管混合溶液滴涂在電極表面，于室溫晾干；

（4）羧基活化：將步驟（3）所制備電極浸泡在300μL現配的活化液中30min，用于活化單壁碳納米管上的羧基；

（5）探針和適配體的固定：將步驟（4）獲得的電極浸入含有20nM氨基修飾捕獲探針（AMP）的15mM PBS（pH7.0）的溶液中反應2h，使得溶液中捕獲探針的氨基與步驟（4）制得電極上活化的羧基脫水縮合，從而將氨基修飾捕獲探針固定于復合材料上；用15mM，pH 7.0的PBS沖洗修飾的電極以除去未結合的AMP，再將其與20nM毒死蜱適配體孵育1h，以形成AMP和毒死蜱適配體之間的雜交，最后用PBS洗滌制備的電極以除去未結合的毒死蜱適配體。

4.根據權利要求2所述適配體電化學傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟（3）所述的氧化銅納米花-單壁碳納米管混合溶液為氧化銅納米花溶液和單壁碳納米管溶液按體積比1：2-2：1混合。

5.根據權利要求2所述適配體電化學傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟（4）所述的活化液為10.0mM 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和16.0mM N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）。

6.根據權利要求2所述適配體電化學傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟（5）所述的捕獲探針具有如SEQ ID NO.2 所示核苷酸序列，并且5’端具有氨基修飾，序列如下：

5’-NH₂-(CH₂)₆-ACGATGCGGGTGCCAAGCTT -3’。

7.一種適配體電化學傳感器檢測毒死蜱的方法，其特征在于，采用權利要求1或2所述適配體電化學傳感器，包括以下步驟：

（1）工作電極的預處理：將電極與40-50μM 亞甲基藍（MB）溶液一起孵育30min，使MB在適配體修飾的玻碳電極表面上的積累，用PBS徹底清洗電極以除去未結合的MB；

（2）制作標準曲線：將步驟（1）處理好的工作電極放入不同濃度的毒死蜱標準品溶液中孵育2h，通過DPV檢測電極，記錄下電流響應值,獲得基于適配體的生物傳感器對不同濃度的毒死蜱農藥溶液的電流響應值，得到電流與毒死蜱濃度之間的線性關系標準曲線；

（3）測定樣品毒死蜱濃度：利用步驟（1）處理好的工作電極放入樣品溶液中孵育2h，通過DPV檢測電極，記錄電流響應值，然后根據步驟（3）獲得的標準曲線，即可計算出樣品中毒死蜱濃度；

（4）電極再生：在室溫下將生物傳感器浸入6-8M尿素溶液，30-60min后電極即再生，所述再生電極可與適配體重新結合并重復使用。