[發明專利]多重耐藥鮑曼不動桿菌核酸檢測液相芯片及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201710788426.1
• 申請日: 2017-09-05
• 公開（公告）號: CN107619871A
• 公開（公告）日: 2018-01-23
• 發明（設計）人: 黃寧;宮維平;柳曉
• 申請（專利權）人: 山東立菲生物產業有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C40B40/06;C40B50/06;C12R1/01
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司11429
• 代理人: 李晶晶

技術領域

本發明涉及一種多重耐藥鮑曼不動桿菌液相芯片及其制備方法與應用，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

2010年，隨著“超級細菌”這一名詞頻繁地見諸報端，細菌多重耐藥、抗生素的合理使用重返人們視線。超級細菌其實并非新事物，它不是一個細菌的名稱，而是一類細菌的名稱，這一類細菌的共性是對幾乎所有的抗生素都有強勁的耐藥性，它們一直存在并且隨著人類濫用抗生素而進化出強大耐藥性。細菌耐藥性，尤其是多重耐藥性(multidrugresistance,MDR)已經成為非常嚴重的醫療問題及社會問題。

細菌耐藥機理十分復雜，在抗生素的壓力選擇下，臨床細菌耐藥狀況的日益惡化。細菌耐藥性的檢測與監測對于正確的目標性抗感染治療以及監測細菌耐藥性變遷和耐藥菌感染的流行病學調查，制定防控細菌耐藥性增加的措施至關重要。然而，目前臨床實驗室多采用耐藥表型的檢測方法，其檢測周期長時效性差、檢測通量低、影響因素多是最主要的問題，不能滿足目前臨床抗感染治療和醫院感染控制的要求。

液態芯片(又稱流式熒光技術、液相芯片、懸浮陣列等)是在后基因組時代發展起來的新一代標準化開放式高通量技術平臺，它有機地整合了編碼微球、激光技術、應用流體學、最新的高速數字信號處理器和計算機運算法則，具有高通量、高速度、低成本、靈敏度高、重復性好、線性范圍廣等優點，可廣泛應用于免疫分析、核酸研究、酶學分析、受體和配體識別分析等研究，也是是目前唯一得到權威機構和醫學界共同認可用于臨床診斷的生物芯片平臺。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：利用液態芯片技術，提供一種多重耐藥鮑曼不動桿菌液相芯片及其制備方法與應用。

本發明提供的多重耐藥鮑曼不動桿菌核酸檢測液相芯片，包括對應鮑曼不動桿菌不同耐藥基因的微球、探針、特異性引物、生物素結合的引物及鏈霉親和素-藻紅蛋白。

鮑曼不動桿菌8種耐藥基因分別是OXA23、TEM、IMP、VIM、AMPC、AAC3、AAC6’、GYRA。

所述微球是分別與針對上述8種耐藥基因的特異性探針偶聯的8種微球。

所述探針是針對上述8種耐藥基因的氨基化的特異性探針。

所述特異性引物能對上述8種耐藥基因進行特異性擴增。

其探針序列為

其引物序列為：

本發明還提供一種多重耐藥鮑曼不動桿菌核酸檢測液相芯片的制備方法，包括如下步驟：

(1)微球與氨基化的探針偶聯形成偶聯體，分別選取8種不同熒光色的羧基微球，洗滌、活化羧基微球；以不同微球的順序分別對應地加入針對OXA23、TEM、IMP、VIM、AMPC、AAC3、AAC6’、GYRA耐藥基因的特異性氨基化探針；加入EDC混勻，室溫下，以200～250rpm的轉速放在搖床上孵育120分鐘；重復1～2次；用PBS-TBN洗滌2～3次；分別得到8種不同特異性探針與微球形成的偶聯體；計數單位體積每種微球偶聯體的數，分別于4℃條件下避光保存；使用時，依據檢測項目選擇混合。

(2)將特異性探針與微球偶聯的偶聯體、特異性引物、活化的生物素標記的通用引物、鏈霉親和素- 藻紅蛋白按比例配置，得到多重耐藥鮑曼不動桿菌核酸檢測液相芯片。

本發明提供的多重耐藥鮑曼不動桿菌核酸檢測液相芯片在檢測試劑中的應用。

.將標記有探針的微球偶聯體、特異性引物、作為報告分子的活化的生物素標記的通用引物、鏈霉親和素-藻紅蛋白按比例配置，探針與相應的目的核酸特異性的結合，帶有生物素標記的報告分子也與鏈霉親和素-藻紅蛋白特異性的結合，將混合物上樣到液相芯片分析系統，采用液相芯片分析技術將微球偶聯體分為單個細胞流，利用紅、綠兩束激光檢測，獲得光信號、處理數據就可完成對生物反應的實時、定量分析。

本發明的有益效果：

本發明提供的液相芯片檢測迅速準確、省時省力，可以同時檢測并區分鮑曼不動桿菌的8種耐藥基因。

具體實施方式

實施例1：探針與已知編號的微球的偶聯

(1)分別選取8種不同熒光色羧基化微球，用漩渦震蕩器振蕩微球懸液，時間20s，使微球混合均勻。

(2)分別取上述各號羧基微球大約2×103個，分別轉移到離心管中，≥8000×g離心2min，沉淀羧基微球。

(3)移走上清，加入100μldH2O，用漩渦震蕩器振蕩20s重懸微球，≥8000×g離心2min，沉淀羧基微球。