[發明專利]一種從尿液中檢測骨骼肌微損傷標志物肌紅蛋白的方法

在審

• 申請號: 201710787397.7
• 申請日: 2017-09-04
• 公開（公告）號: CN107505299A
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發明（設計）人: 糜漫天;易龍;張乾勇;周曦;郎和東;吳璐婷
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/533
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司44245
• 代理人: 李歐

技術領域

本發明涉及醫學檢測技術領域，尤其涉及一種從尿液中檢測骨骼肌微損傷標志物肌紅蛋白的方法。

背景技術

運動性骨骼肌微損傷是一種高強度或/和長時間運動后發生的骨骼肌纖維的微細損傷，不同于運動創傷學中的肌肉挫傷、拉傷等，常表現肌肉酸痛。肌肉酸痛是由劇烈的、超過習慣負荷的骨骼肌舒縮活動所引起的，特別是在骨骼肌進行離心收縮后最容易發生。具體表現為，通常在運動結束后24h出現、24h～48h達高峰、持續5d～7d或更長時間后逐漸緩解、消失；肌肉酸痛程度與肌肉活動的劇烈程度、持續時間以及骨骼肌收縮形式相關，如離心收縮＞等長收縮＞向心收縮；肌肉酸痛同時伴有肌力減退、僵硬、活動功能下降等，肌電圖、血清酶及超微結構形態均有不同程度的改變。

軍事訓練傷防控不僅依賴于科學施訓，更應當重視醫務監督對訓練傷發生預測及現場監測中的重要作用。戰士在軍事訓練中常出現疲勞積累并造成過度疲勞綜合征，繼續堅持訓練往往易發生訓練傷病，尤其是骨骼肌微損傷的肌肉酸痛癥狀具有延遲性，需要運動后一段時間才能知曉。因此，如何早期診斷運動性疲勞是預防訓練傷病的關鍵。業已證明，肌紅蛋白是評定肌肉承受訓練刺激、運動性疲勞及骨骼肌微損傷的敏感標志物。

肌紅蛋白(Mb)是一種小分子單體血紅素蛋白，存在于肌細胞中，其功能是儲存和運輸氧氣，即把血液中的氧通過細胞膜運輸到肌細胞中，以氧合Mb的形式暫時儲存，保證肌肉劇烈活動時對氧的需要，因此Mb對運動能力有重要作用。此外Mb對微血管和組織中的一氧化氮具有調節作用，促進血紅素中的Fe³⁺釋放并造成線粒體膜脂質過氧化。劇烈運動后Mb在30min內升高并可持續數天，故可作為訓練負荷的監控指標。當肌肉組織受損傷時，Mb可大量釋放至細胞外進入血循環，一旦血漿中出現肌紅蛋白，因其相對分子質量較小可迅速通過腎小球濾過而由腎臟排出，其濃度超過腎閾，出現肌紅蛋白尿，尿液呈粉紅色，但很快變為棕色或棕黑色。因此，可以通過從尿液中檢測肌紅蛋白濃度判斷是否發生骨骼肌微損傷，為科學施訓提供參考指導數據。

目前臨床常用檢測肌紅蛋白的方法多用于血液中肌紅蛋白的檢測，主要有ELISA法、膠體金法和化學發光法等。其中ELISA法適合大批量檢測，但重復性差，操作復雜；膠體金法特異性相對較好，但敏感度偏低；化學發光法靈敏度高，特異性好，但成本要求過高。從血液中檢測肌紅蛋白必定會涉及血液的采集，這會給施訓人員帶來痛苦，從尿液中檢測肌紅蛋白可以取樣對施訓人員造成的痛苦，但是目前相關檢測方法報道較少，因此需要尋找一種能夠快速從尿液中檢測肌紅蛋白的高靈敏度、抗干擾性強、重復性好的方法。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的是提供一種從尿液中檢測骨骼肌微損傷標志物肌紅蛋白的方法，該方法以NiFe₂O₄-CMCS復合納米顆粒為載體，與尿液中的肌紅蛋白結合形成免疫復合物，再結合負載在SNP-ZnSe/ZnS熒光納米球上的酶標肌紅蛋白抗體，通過檢測熒光強度實現了對肌紅蛋白的定量檢測，該方法具有靈敏度較高、抗干擾性較強、重復性較好等特點。

本發明通過以下技術手段解決上述技術問題：

一種從尿液中檢測骨骼肌微損傷標志物肌紅蛋白的方法，包括以下步驟：

緩沖液配置：取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液與0.2mol/L氫氧化鈉溶液按體積比10:7混合，加去離子水稀釋混勻得到pH＝7.2的10mmol/L的PB緩沖液，取嗎啉乙磺酸和鹽酸溶液加入去離子水中混勻得到pH＝6.5的10mmol/L的MES緩沖液。

分散液A配置：取NiFe₂O₄-CMCS復合納米顆粒，加入EDC溶液和NHS溶液攪拌,磁分離洗滌后的納米顆粒與9.5mg/mL肌紅蛋白抗體溶液反應，磁分離洗滌得到NiFe₂O₄-CMCS-antibody免疫磁納米顆粒，浸入保存液中，保存于0℃～5℃的冰箱中。

分散液B配置：取SNP-ZnSe/ZnS熒光納米球，加入EDC溶液和NHS溶液攪拌,磁分離洗滌后的納米球與9.5mg/mL酶標肌紅蛋白抗體溶液反應，磁分離洗滌得到SNP-ZnSe/ZnS-antibody免疫熒光納米球，浸入保存液中，保存于0℃～5℃的冰箱中。

標液配置：精確稱取3份以上不同質量的肌紅蛋白標準品分別加入不同試管中，向各試管中移取PB緩沖液振蕩溶解，配制成不同濃度的標準儲備液，保存于0℃～5℃的冰箱中。