[發(fā)明專利]一種從尿液中檢測(cè)骨骼肌微損傷標(biāo)志物肌紅蛋白的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710787397.7
• 申請(qǐng)日: 2017-09-04
• 公開（公告）號(hào): CN107505299A
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 糜漫天;易龍;張乾勇;周曦;郎和東;吳璐婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;G01N33/533
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司44245
• 代理人: 李歐

1.一種從尿液中檢測(cè)骨骼肌微損傷標(biāo)志物肌紅蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟：

緩沖液配置：取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液與0.2mol/L氫氧化鈉溶液按體積比10:7混合，加去離子水稀釋混勻得到pH＝7.2的10mmol/L的PB緩沖液，取嗎啉乙磺酸和鹽酸溶液加入去離子水中混勻得到pH＝6.5的10mmol/L的MES緩沖液；

分散液A配置：取NiFe₂O₄-CMCS復(fù)合納米顆粒，加入EDC溶液和NHS溶液攪拌,磁分離洗滌后的納米顆粒與9.5mg/mL肌紅蛋白抗體溶液反應(yīng)，磁分離洗滌得到NiFe₂O₄-CMCS-antibody免疫磁納米顆粒，浸入保存液中，保存于0℃～5℃的冰箱中；

分散液B配置：取SNP-ZnSe/ZnS熒光納米球，加入EDC溶液和NHS溶液攪拌,磁分離洗滌后的納米球與9.5mg/mL酶標(biāo)肌紅蛋白抗體溶液反應(yīng)，磁分離洗滌得到SNP-ZnSe/ZnS-antibody免疫熒光納米球，浸入保存液中，保存于0℃～5℃的冰箱中；

標(biāo)液配置：精確稱取3份以上不同質(zhì)量的肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別加入不同試管中，向各試管中移取PB緩沖液振蕩溶解，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于0℃～5℃的冰箱中；

標(biāo)樣檢測(cè)：按以下方法分別測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的熒光值，取400μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用PB緩沖液稀釋至1mL，加入150μL分散液A，振蕩15min后，再加入150μL分散液B，繼續(xù)振蕩15min后，用PB緩沖液磁分離洗滌3次以上，再均勻分散于250μL的PB緩沖液中，用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光檢測(cè)得到熒光值，以標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的熒光值為縱坐標(biāo)繪制擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線；

樣品檢測(cè)：取中段尿液于冷凍離心機(jī)中離心10min～15min，取上清液攪拌加入硫酸銨至液體飽和，過(guò)濾得到樣品液，取350μL～380μL樣品液用PB緩沖液稀釋至1mL，加入120μL～150μL分散液A，振蕩8min～15min后，再加入120μL～150μL分散液B，振蕩8min～15min后，用PB緩沖液磁分離洗滌3次以上，再均勻分散于250μL的PB緩沖液中，進(jìn)行熒光檢測(cè)得到熒光值，將熒光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中便得到相應(yīng)的濃度值，即完成尿液中肌紅蛋白的檢測(cè)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從尿液中檢測(cè)骨骼肌微損傷標(biāo)志物肌紅蛋白的方法，其中，所述保存液為含有0.1％BSA、0.03％吐溫-20的PB緩沖液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從尿液中檢測(cè)骨骼肌微損傷標(biāo)志物肌紅蛋白的方法，其中，所述分散液A的配置方法如下：取NiFe₂O₄-CMCS用PB緩沖液磁分離洗滌3次以上后，加入2mLPB緩沖液中，配制得到濃度為10mg/mL的溶液，加入85μL0.1mol/LEDC的溶液和125μL0.1mol/L的NHS溶液，攪拌0.5h，PB緩沖液磁分離洗滌3次，再均勻分散于2mLPB緩沖液中，攪拌加入3.5μL肌紅蛋白抗體溶液，振蕩10min，靜置1h，慢速攪拌10min～15min，PB緩沖液磁分離洗滌3次，再加入2mLPB緩沖液中，加入150μL0.1mol/L鹽酸羥胺溶液攪拌1.5h，磁分離得到的NiFe₂O₄-CMCS-antibody固相產(chǎn)物，用PB緩沖液磁分離洗滌3次，浸入2mL0℃～5℃的保存液中。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種從尿液中檢測(cè)骨骼肌微損傷標(biāo)志物肌紅蛋白的方法，其中，所述NiFe₂O₄-CMCS復(fù)合納米顆粒是以納米鐵酸鎳為核心外包覆羧甲基殼聚的多面體多孔顆粒，所述NiFe₂O₄-CMCS顆粒制備如下：將等摩爾量的羧甲基殼聚糖和NiFe₂O₄納米顆粒超聲溶于去離子水中攪拌混勻得到分散相，將聚山梨酯-80和司盤80加入礦物油混勻得到連續(xù)相，于連續(xù)相中加入分散相攪拌1.5h,再加入戊二醛反應(yīng)2.5h，過(guò)濾得到的顆粒物先后用石油醚、去離子水和乙醇洗滌，于55℃真空干燥10h～13h，得到NiFe₂O₄-CMCS納米顆粒。