[發(fā)明專利]Illumina平臺高通量測序文庫定量標準物質(zhì)的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710787170.2
• 申請日: 2017-09-04
• 公開（公告）號: CN107447015B
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 董蓮華;王晶;傅博強;唐治玉
• 申請（專利權(quán)）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6851;C12Q1/10;C12R1/19
• 代理公司: 北京雙收知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11241
• 代理人: 盧新

本發(fā)明公開了一種Illumina平臺高通量測序文庫定量標準物質(zhì)的制備方法，將大腸桿菌基因組DNA經(jīng)過超聲波片斷化，通過末端修復(fù)和接頭連接，磁珠選擇回收后可獲得文庫定量標準物質(zhì)，再通過建立的染料數(shù)字PCR方法進行量值的確定。本發(fā)明提供了標準物質(zhì)的制備方法，采用片段化的大腸桿菌基因組DNA作為文庫定量標準物質(zhì)，可以更好的模擬實際檢測中樣本的文庫構(gòu)建。本標準物質(zhì)的定值方法準確度高，不依賴于DNA標準品，測量結(jié)果可溯源至個數(shù)，從而保證測量結(jié)果的可靠和可溯源。本標準物質(zhì)可作為測量標準用于illumina平臺高通量測序文庫DNA的準確定量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種高通量測序文庫定量標準物質(zhì)的制備方法。

背景技術(shù)

基因測序技術(shù)和產(chǎn)業(yè)開始于1990年啟動的人類基因組計劃，是被全球生物科技界公認的對人類健康事業(yè)影響深遠的基礎(chǔ)性技術(shù)和效益外溢性極強的產(chǎn)業(yè)。具有超高測序通量的新一代DNA測序(Next generation sequencing,NGS)推動基因產(chǎn)業(yè)以超摩爾定律的速度迅猛發(fā)展。基因序列測量的準確性直接關(guān)系到人們對于生命活動的判斷，例如癌癥診斷、品種鑒定等。由于NGS一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測序,使得對一個物種的基因組深度測序變得方便易行。

目前市場主流NGS測序儀包括Illumina和Life Technologies公司的測序平臺，這兩大測序平臺文庫的定量分析和質(zhì)量評價對于獲得高質(zhì)量的核酸測序數(shù)據(jù)十分關(guān)鍵。如果過高的估計測序文庫拷貝數(shù)，將不能獲得足夠的測序數(shù)據(jù)，導(dǎo)致降低數(shù)據(jù)產(chǎn)出；如果過低的估計測序文庫拷貝數(shù)，將產(chǎn)生低質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，甚至會導(dǎo)致測序失敗。因此，要控制NGS測序文庫的載入量，保證測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，就需要在測序前對DNA測序文庫進行定量分析。此外，為減少NGS運行成本，往往需要將不同測序文庫等摩爾量合并為一份測序樣品同時測序，這也以測序文庫的準確定量分析為前提，這樣才能保證不同文庫的測序數(shù)據(jù)的可靠性。

目前國內(nèi)尚無針對高通量測序文庫定量標準物質(zhì)的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種Illumina平臺高通量測序文庫定量標準物質(zhì)的制備方法。該方法獲得的高通量測序文庫定量標準物質(zhì)量值準確度高，適用性強。

本發(fā)明首次建立了高通量測序文庫定量標準物質(zhì)的制備方法，達到了上述發(fā)明目的。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

(1)提取大腸桿菌的基因組DNA，采用超聲波進行片斷化。

(2)對片斷化的DNA進行末端修復(fù)，接頭連接，磁珠選擇性回收可獲得文庫定量標準物質(zhì)。

(3)采用染料法數(shù)字PCR進行摩爾濃度的確定。

其具體方法為：

步驟(1)中的大腸桿菌的基因組DNA，當被測樣本為人基因組時，可替換為其他非人來源的基因組DNA；當被測樣本為微生物時,可替換為其它非目標微生物或人源的基因組DNA。大腸桿菌的基因組DNA片斷化的DNA長度大小為200bp左右，在連接接頭后的長度為355bp左右。

超聲破處理片斷化的條件為：采用聲波聚焦超聲波破碎儀處理，強度：5，時間：2min，上樣量為100μL，DNA濃度：10-50ng/μL，工作循環(huán)：10％，爆破/循環(huán)：200，溫度：4℃；

所述的片斷化是指采用超聲波處理使其片斷化，優(yōu)選的實驗條件為：采用聲波聚焦超聲波破碎儀處理，強度：5，時間：6min，上樣量為100μL，DNA濃度：10-50ng/μL，工作循環(huán)：10％，爆破/循環(huán)：200，溫度：4℃；

標準物質(zhì)的定值方法為數(shù)字PCR方法，反應(yīng)體系為：20μL反應(yīng)體系：2×SYBR PCRmastermix 10μL，雙向引物(10μM)0.4μL，DNA模板4μL，ddH₂O 5.6μL。