[發(fā)明專利]Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序文庫(kù)定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710787170.2
• 申請(qǐng)日: 2017-09-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107447015B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董蓮華;王晶;傅博強(qiáng);唐治玉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/6851;C12Q1/10;C12R1/19
• 代理公司: 北京雙收知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11241
• 代理人: 盧新

1.一種Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序文庫(kù)定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，包括以下步驟：

（1）提取大腸桿菌的基因組DNA，采用超聲波進(jìn)行片斷化；

（2）對(duì)片斷化的DNA進(jìn)行末端修復(fù)，接頭連接，磁珠選擇性回收可獲得文庫(kù)定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；其中，主帶為355bp左右，分布范圍為255bp至475bp；

（3）采用染料法數(shù)字PCR進(jìn)行摩爾濃度的確定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序文庫(kù)定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于：所述步驟（1）中，片斷化的DNA長(zhǎng)度大小為200bp左右。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序文庫(kù)定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于：所述步驟（2）中，所確定磁珠回收的片斷大小為355bp左右。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序文庫(kù)定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于：超聲破處理片斷化的條件為：采用聲波聚焦超聲波破碎儀處理，強(qiáng)度：5，時(shí)間：2min，上樣量為100 μL，DNA濃度：10-50 ng/μL，工作循環(huán)：10%，爆破/循環(huán)：200，溫度：4℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序文庫(kù)定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于：步驟（3）所述的方法為數(shù)字PCR方法，反應(yīng)體系為：20μL反應(yīng)體系：2×SYBR PCRmastermix 10 μL，雙向引物（10μM）0.4μL，DNA模板4μL，ddH₂O 5.6 μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序文庫(kù)定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于：步驟（3）中的PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min，95℃20s，60℃40s，45 cycles，溶解曲線：95℃5s，65℃ 1min，95度連續(xù)采集信號(hào)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-3、5-6任一項(xiàng)所述的Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序文庫(kù)定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于：步驟（1）中的大腸桿菌的基因組DNA，當(dāng)被測(cè)樣本為人基因組時(shí)，可替換為其他非人來(lái)源的基因組DNA；當(dāng)被測(cè)樣本為微生物時(shí),可替換為其它非目標(biāo)微生物或人源的基因組DNA。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序文庫(kù)定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于：步驟（1）中的大腸桿菌的基因組DNA，當(dāng)被測(cè)樣本為人基因組時(shí)，可替換為其他非人來(lái)源的基因組DNA；當(dāng)被測(cè)樣本為微生物時(shí),可替換為其它非目標(biāo)微生物或人源的基因組DNA。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-3、5-6任一項(xiàng)所述的Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序文庫(kù)定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于：所述的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是稀釋至拷貝數(shù)濃度在10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copy/μL。

10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序文庫(kù)定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于：所述的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是稀釋至拷貝數(shù)濃度在10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copy/μL。

11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序文庫(kù)定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于：所述的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是稀釋至拷貝數(shù)濃度在10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copy/μL。

12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序文庫(kù)定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于：所述的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是稀釋至拷貝數(shù)濃度在10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copy/μL。