[發明專利]檢測雞鼻炎型克雷伯氏菌的環介導等溫擴增試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201710786131.0
• 申請日: 2017-09-04
• 公開（公告）號: CN107419027A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 楊金龍;戴茜茜;殷素會;許國洋;周嬋;王海燕;谷山林;王介平;呂金鳳;王小燕;李晉
• 申請（專利權）人: 重慶市畜牧科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12R1/22
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及檢測雞鼻炎型克雷伯氏菌的環介導等溫擴增試劑盒，還涉及利用該試劑盒檢測雞鼻炎型克雷伯氏菌的方法。

背景技術

目前，原微生物的檢測方法主要有分離培養鑒定法、聚合酶鏈式反應(PCR)法和熒光定量PCR(FQ-PCR)法，但分離培養鑒定法操作繁瑣、費時，PCR法和FQ-PCR法需要昂貴的儀器和試劑，檢測成本高，不適合中小型單位和現場檢測應用。

環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術與其它核酸擴增技術相比，可以在等溫條件下快速、高效、特異地擴增靶序列，且操作簡便，不需要昂貴的儀器和試劑，成本低，已在病原微生物檢測領域顯示出廣闊的發展前景。但擴增過程中仍需要價格較高的DNA聚合酶，如果能減少DNA聚合酶的使用量將對進一步降低病原微生物檢測成本具有重要意義。

克雷伯氏菌屬(Klebsiella)為革蘭氏陰性桿菌。主要有肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)、臭鼻克雷伯氏菌(K.ozaenae)和鼻硬結克雷伯氏菌(k.rhinoscleromatis)。其中臭鼻克雷伯氏菌對家禽致病性較強，是重要的條件致病菌和醫源性感染菌之一。由其引起的雞鼻炎型克雷伯氏菌病是危害雞、火雞和山雞等家禽和野禽的一種接觸性傳染病。該病發病率和死亡率通常在10～30％，但有的雞場感染雞鼻炎型克雷伯氏菌的病雞死亡率高達75％。一旦某地區的雞群發生雞鼻炎型克雷伯氏菌感染，該病就會成為地方性疾病，很難徹底根除，并且經常反復爆發，帶來巨大的經濟損失。雞鼻炎型克雷伯氏菌感染以引起慢性萎縮性鼻炎，有惡臭，以及敗血癥、泌尿系感染等為主要病理特征，在病理學上很難與副雞嗜血桿菌性鼻炎感染進行區別。因此有必要建立一種低成本的檢測雞鼻炎型克雷伯氏菌病的方法。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供檢測雞鼻炎型克雷伯氏菌的環介導等溫擴增試劑盒靈敏度高，特異性好，操作簡便快速，結果準確可靠，檢測成本低，適合中小型單位和現場檢測應用；本發明的目的之二在于提供利用所述試劑盒檢測雞鼻炎型克雷伯氏菌的方法。

為實現上述發明目的，本發明提供如下檢測方案：

1、檢測雞鼻炎型克雷伯氏菌的環介導等溫擴增試劑盒，包括如下組分：環介導等溫擴增內引物和外引物，嗜熱乳酸枯草芽孢桿菌DNA聚合酶、10×熱聚合反應緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物、硫酸鎂、甜菜堿、右旋糖苷、黃芪多糖和熒光染料賽博綠Ⅰ；所述10×熱聚合反應緩沖液由濃度為150-250mmol/L、pH為8.5-8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、濃度為50-100mmol/L的氯化鉀、濃度為50-100mmol/L的硫酸銨、濃度為15-20mmol/L的硫酸鎂和質量分數為0.5-1％的曲拉通X-100組成；所述三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物由三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸組成；所述環介導等溫擴增內引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述外引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

優選的，所述環介導等溫擴增內引物濃度分別為5μmol/L；所述外引物濃度分別為20μmol/L。

優選的，所述嗜熱乳酸枯草芽孢桿菌DNA聚合酶濃度為8U/μl、所述三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物各組分濃度為10mmol/L、硫酸鎂濃度為100mmol/L、甜菜堿濃度為2mol/L、右旋糖苷濃度為4mol/L，黃芪多糖濃度為4mol/L和熒光染料賽博綠Ⅰ質量分數為10％。

優選的，所述10×熱聚合反應緩沖液由濃度為250mmol/L、pH為8.8的Tris–HCl、濃度為100mmol/L的氯化鉀、濃度為100mmol/L的硫酸銨、濃度為20mmol/L的硫酸鎂和質量分數為1％的Triton X-100組成。

2、利用所述試劑盒檢測雞鼻炎型克雷伯氏菌的方法，包括以下步驟：

a、提取待檢樣品的細菌DNA作為模板DNA，控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值為1.6～2.0，濃度為10～100ng/μl；