[發明專利]檢測雞鼻炎型克雷伯氏菌的環介導等溫擴增試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201710786131.0
• 申請日: 2017-09-04
• 公開（公告）號: CN107419027A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 楊金龍;戴茜茜;殷素會;許國洋;周嬋;王海燕;谷山林;王介平;呂金鳳;王小燕;李晉
• 申請（專利權）人: 重慶市畜牧科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12R1/22
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司11275
• 代理人: 趙榮之

1.檢測雞鼻炎型克雷伯氏菌的環介導等溫擴增試劑盒，其特征在于，包括如下組分：環介導等溫擴增內引物和外引物，嗜熱乳酸枯草芽孢桿菌DNA聚合酶、10×熱聚合反應緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物、硫酸鎂、甜菜堿、右旋糖苷、黃芪多糖和熒光染料賽博綠Ⅰ；所述10×熱聚合反應緩沖液由濃度為150-250mmol/L、pH為8.5-8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、濃度為50-100mmol/L的氯化鉀、濃度為50-100mmol/L的硫酸銨、濃度為15-20mmol/L的硫酸鎂和質量分數為0.5-1％的曲拉通X-100組成；所述三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物由三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸組成；所述環介導等溫擴增內引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述外引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述環介導等溫擴增內引物濃度分別為5μmol/L；所述外引物濃度分別為20μmol/L。

3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于：所述嗜熱乳酸枯草芽孢桿菌DNA聚合酶濃度為8U/μl、所述三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物各組分濃度為10mmol/L、硫酸鎂濃度為100mmol/L、甜菜堿濃度為2mol/L、右旋糖苷濃度為4mol/L，黃芪多糖濃度為4mol/L和熒光染料賽博綠Ⅰ質量分數為10％。

4.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于：所述10×熱聚合反應緩沖液由濃度為250mmol/L、pH為8.8的Tris–HCl、濃度為100mmol/L的氯化鉀、濃度為100mmol/L的硫酸銨、濃度為20mmol/L的硫酸鎂和質量分數為1％的Triton X-100組成。

5.利用權利要求1～4任一項所述試劑盒檢測雞鼻炎型克雷伯氏菌的方法，其特征在于：包括以下步驟：

a、提取待檢樣品的細菌DNA作為模板DNA，控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值為1.6～2.0，濃度為10～100ng/μl；

b、雞鼻炎型克雷伯氏菌的環介導等溫擴增：在反應管中配制環介導等溫擴增反應體系，各組分終濃度如下：濃度各為0.1-0.2μmol/L的內引物，濃度各為0.5-0.8μmol/L的外引物，5-8U嗜熱乳酸枯草芽孢桿菌DNA聚合酶，1×熱聚合反應緩沖液，濃度各為0.5-1mmol/L的三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸，濃度為2-3mmol/L的硫酸鎂，濃度為0.25-0.5mol/L的甜菜堿，濃度為0.05～0.25mol/L的右旋糖苷，濃度為0.05～0.25mol/L的黃芪多糖，待檢模板DNA水溶液0.5-1μl，余量為水；將反應管于60～65℃水浴中保溫反應20～30分鐘，再于80～95℃水浴中保溫3～5分鐘終止反應；所述內引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述外引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

c、顯色檢測：在反應管中加入質量分數為10％的熒光染料賽博綠Ⅰ水溶液0.5-1μl，用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢樣品中不含有雞鼻炎型克雷伯氏菌；如果顏色變為綠色，說明待檢樣品中含有雞鼻炎型克雷伯氏菌。