[發(fā)明專利]一種HCMVpp65抗原血癥競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA法檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710777953.2
• 申請(qǐng)日: 2017-08-31
• 公開（公告）號(hào): CN107632154A
• 公開（公告）日: 2018-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王明麗;陳鯤鵬;趙俊;張文昌;魯江徽
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 王明麗
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569;G01N33/543;G01N33/535;G01N33/68
• 代理公司: 合肥天明專利事務(wù)所(普通合伙)34115
• 代理人: 趙瑜,金凱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是用于HCMV活動(dòng)性感染診斷的一種HCMV pp65抗原血癥競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA法檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

人巨細(xì)胞病毒(human Cytomegalovirus,HCMV)屬于皰疹病毒β亞科，為雙鏈DNA病毒。在全球范圍成人血清抗體陽(yáng)性率為60～90％以上。在發(fā)展中國(guó)家，約有80％兒童在2歲以前就已經(jīng)感染該病毒，至成年幾乎所有人已感染。HCMV的原發(fā)感染多發(fā)生在20歲以前，大多為隱性感染，不引起嚴(yán)重的癥狀。與所有的皰疹病毒一樣，一旦發(fā)生感染，HCMV會(huì)在宿主體內(nèi)(唾液腺、白細(xì)胞等處)建立持續(xù)終生的潛伏感染，潛伏感染常會(huì)間斷性地被激活而發(fā)生復(fù)發(fā)性感染。HCMV感染在免疫正常者大多無臨床癥狀，但免疫功能低下者(AIDS患者、器官和細(xì)胞移植受者)則為致命性感染，導(dǎo)致死亡；孕婦妊娠期原發(fā)性CMV感染可能經(jīng)過胎盤血路感染胎兒，導(dǎo)致胎兒出生缺陷，如神經(jīng)性耳聾(SNHI)和智力發(fā)育遲緩等。對(duì)HCMV易感人群中，常引起顯性感染，其主要臨床癥狀有：發(fā)燒、白細(xì)胞減少癥、乏力、肝炎、肺炎、胃腸病、視網(wǎng)膜炎等；

近期的研究表明，在臨床眾多的炎癥性疾病和腫瘤疾病中，HCMV同樣扮演著重要角色。如已發(fā)現(xiàn)，HCMV與動(dòng)脈粥樣硬化有密切的相關(guān)性，HCMV潛伏感染的再激活可引起病毒介導(dǎo)的血管炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，血管平滑肌細(xì)胞增生等。

由于HCMV活動(dòng)性感染時(shí)發(fā)生的臨床癥狀沒有特征性，因此，僅憑臨床經(jīng)驗(yàn)醫(yī)生難以及早做出明確診斷，而早期治療卻對(duì)于HCMV感染患者的預(yù)后至關(guān)重要:可以大大降低患者血流中的病毒載量，減少對(duì)機(jī)體的病理?yè)p害。但傳統(tǒng)病毒分離培養(yǎng)法雖然被認(rèn)為是HCMV活動(dòng)性感染診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，由于需要4周左右才能判定結(jié)果，無法進(jìn)行早期診斷；而市場(chǎng)上用于檢測(cè)HCMV特異性IgM抗體的ELISA試劑盒，可能會(huì)因?yàn)槊庖咭种苹颊咛禺愋钥贵w應(yīng)答能力的減弱或抗體延遲出現(xiàn)，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性而檢出率低。根據(jù)目前臨床實(shí)踐顯示，可以通過檢測(cè)患者HCMV pp65抗原血癥，以準(zhǔn)確檢測(cè)臨床不同易感人群(尤其是免疫功能低下人群)的人巨細(xì)胞病毒活動(dòng)性感染狀態(tài)。但全球僅荷蘭IQ Products生產(chǎn)的CMV Brite^TM Turbo Kit獲得了FDA的批準(zhǔn)，可正式用于臨床檢測(cè)，但該產(chǎn)品難以被我國(guó)醫(yī)院檢驗(yàn)科接受，主要原因在于該試劑盒采用免疫熒光法，操作特別繁瑣，檢測(cè)過程需要4h以上，不適合大量臨床樣本檢測(cè)。本發(fā)明以安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室四代科研人員數(shù)十年對(duì)HCMV的深入研究而建立的重組蛋白與單克隆抗體研發(fā)平臺(tái)為基礎(chǔ)，將荷蘭IQ Products生產(chǎn)的CMV Brite^TMTurbo Kit產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作為模板，進(jìn)行檢測(cè)方法學(xué)升級(jí)換代，將原來的免疫熒光法改為操作簡(jiǎn)便、特異性好和敏感性高的ELISA法，研制了人巨細(xì)胞病毒pp65抗原血癥ELISA檢測(cè)試劑盒。該試劑盒所用核心原料HCMVpp65多克隆抗體和陽(yáng)性參考品均為自行制備，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。

發(fā)明內(nèi)容

一種HCMV pp65抗原血癥競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA法檢測(cè)試劑盒，該試劑盒主要含有：HCMV pp65重組抗原包被酶標(biāo)反應(yīng)板、HRP標(biāo)記特異性HCMVpp65多克隆抗體或單克隆抗體、樣品稀釋液、辣根過氧化物酶底物顯色液、終止液、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品組成。

優(yōu)選地，所述HCMV pp65重組抗原是以HCMV AD169毒株基因組為模板，用針對(duì)HCMV pp65基因設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將擴(kuò)增得到的HCMV pp65基因與表達(dá)質(zhì)粒pET-32a連接后導(dǎo)入大腸桿菌BL21中原核表達(dá)獲得。

優(yōu)選地，所述特異性引物中，上游引物序列為5’-GGATCCATGGAGTCGCGCGGTC-3’，下游引物序列為5’-GAGCTCACCTCGGTGCTTTTT-3’，上下游引物分別引入BamHI和SacI酶切位點(diǎn)。

優(yōu)選地，所述擴(kuò)增的HCMV pp65目的基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

該競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法步驟包括：樣品稀釋、抗原包被、封閉、混合、反應(yīng)、顯色與終止、數(shù)據(jù)檢測(cè)與處理，其具體操作如下：

步驟1)樣品稀釋：將血清樣品稀釋為原體積的2～4倍，得到待測(cè)血清樣品；

步驟2)抗原包被：用HCMV pp65重組抗原包被酶標(biāo)反應(yīng)板，包被抗原的包被濃度為100～1000ng/孔；

步驟3)封閉：用含1～10％小牛血清的PBS緩沖液封閉步驟2)的酶標(biāo)反應(yīng)板，37℃溫箱封閉30～60min；