[發明專利]一種HCMVpp65抗原血癥競爭抑制ELISA法檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201710777953.2
• 申請日: 2017-08-31
• 公開（公告）號: CN107632154A
• 公開（公告）日: 2018-01-26
• 發明（設計）人: 王明麗;陳鯤鵬;趙俊;張文昌;魯江徽
• 申請（專利權）人: 王明麗
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;G01N33/535;G01N33/68
• 代理公司: 合肥天明專利事務所(普通合伙)34115
• 代理人: 趙瑜,金凱

1.一種HCMV pp65抗原血癥競爭抑制ELISA法檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：HCMV pp65重組抗原包被的酶標反應板、HRP標記的特異性HCMVpp65多克隆抗體或單克隆抗體、樣品稀釋液、辣根過氧化物酶底物顯色液、終止液、陽性對照品、陰性對照品。

2.根據權利要求1所述的一種HCMV pp65抗原血癥競爭抑制ELISA法檢測試劑盒，其特征在于，所述HCMV pp65重組抗原是以HCMV AD169毒株基因組為模板，用針對HCMV pp65基因設計的特異性引物進行PCR擴增，再將擴增得到的HCMV pp65基因與表達質粒pET-32a連接后導入大腸桿菌BL21中原核表達獲得。

3.根據權利要求2所述的一種HCMV pp65抗原血癥競爭抑制ELISA法檢測試劑盒，其特征在于：所述特異性引物中，上游引物序列為5’-GGATCCATGGAGTCGCGCGGTC-3’，下游引物序列為5’-GAGCTCACCTCGGTGCTTTTT-3’，上下游引物分別引入BamHI和SacI酶切位點。

4.根據權利要求2所述的一種HCMV pp65抗原血癥競爭抑制ELISA法檢測試劑盒，其特征在于：所述擴增的HCMV pp65目的基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.利用權利要求1～4任一項所述的HCMV pp65抗原血癥競爭抑制ELISA法檢測試劑盒的檢測方法，該競爭ELISA檢測方法步驟包括：樣品稀釋、抗原包被、封閉、混合、反應、顯色與終止、數據檢測與處理，其特征在于，

步驟1)樣品稀釋：將血清樣品稀釋為原體積的2～4倍，得到待測血清樣品；

步驟2)抗原包被：用HCMV pp65重組抗原包被酶標反應板，包被抗原的包被濃度為100～1000ng/孔；

步驟3)封閉：用含1～10％小牛血清的PBS緩沖液封閉步驟2)的酶標反應板，37℃溫箱封閉30～60min；

步驟4)混合：將步驟1)得到的待測血清樣品、不同濃度梯度陽性對照品或陰性對照品分別與HRP標記特異性HCMVpp65多克隆抗體或單克隆抗體混合，37℃溫箱反應30～60min；

步驟5)反應：將步驟4)得到的混合反應液體加入到步驟3)的酶標反應板中，37℃溫箱反應30～60min；

步驟6)顯色與終止：在步驟5)得到的酶標反應板中加入新鮮配制的底物溶液，振蕩混合后室溫避光孵育10～20min進行顯色，再每孔加入終止液，在450nm處測定吸光值OD₄₅₀nm；

步驟7)數據處理：利用不同濃度梯度陽性對照品得到的吸光值進行線性擬合，得到試劑盒的標準曲線；將待測血清樣品測定的吸光值帶入標準曲線計算出待測樣品血清中HCMV pp65蛋白含量；利用待測血清樣品和陰性對照品測定的吸光值計算待測血清樣品的抑制率并進行判定。

6.根據權利要求5所述的一種HCMV pp65抗原血癥競爭抑制ELISA法檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，所述抑制率的計算通過以下公式進行：

抑制率＝100×(1-OD_待檢樣品/OD_陰性對照)％；

其中OD_陰性對照為HRP標記特異性HCMVpp65抗體和陰性對照品混合的板孔的OD₄₅₀值；OD_待檢樣品為加入了HRP標記特異性HCMVpp65抗體和待檢血清樣品的板孔的OD₄₅₀值；

判定待檢血清樣品：抑制率≥30％，則判定待檢血清樣品為陽性。