[發(fā)明專利]一種麥芽糖轉(zhuǎn)化率提高的海藻糖合酶及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710776826.0
• 申請日: 2015-04-28
• 公開（公告）號: CN107384902B
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳敬;謝艷萍
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南匯升生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/70;C12P19/12
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種麥芽糖轉(zhuǎn)化率提高的海藻糖合酶及其制備方法和應(yīng)用，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明將Thermobifida fusca YX的海藻糖合酶活性中心附近第289位的谷氨酸突變成甘氨酸得到突變體E289G；將第295位的組氨酸突變成天冬酰胺突變體H295N；將第344位的甲硫氨酸突變成賴氨酸突變體M344K；將第367位的甲硫氨酸突變成亮氨酸突變體M367L，并在H295N基礎(chǔ)上進(jìn)行雙突變得到突變體H295N/E289G、H295N/M344K、H295N/M367L、H295N/M344K/M367L。突變體實(shí)現(xiàn)了底物中即使含有一定的葡萄糖，海藻糖合酶制備海藻糖的轉(zhuǎn)化效率依然不會(huì)受到很大的影響，具有較高的工業(yè)價(jià)值。

本申請是申請?zhí)枮椋?01510210023.X，申請日為：2015年4月28日，申請名稱為：一種海藻糖合酶的突變體及其制備方法和應(yīng)用的分案申請。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種麥芽糖轉(zhuǎn)化率提高的海藻糖合酶及其制備方法和應(yīng)用，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

海藻糖是一種安全無毒以1,1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性二糖，有三種異構(gòu)體即(α,α)、異海藻糖(β,β)、新海藻糖(α,β)，一般以二水化合物的形式存在。與蛋白質(zhì)或者氨基酸共同加熱，不會(huì)產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，并且在酸性、堿性、高溫、超低溫環(huán)境都能保持一定的穩(wěn)定性。其獨(dú)特的生物活性，使得海藻糖得到廣泛的應(yīng)用。大量的研究表明，海藻糖是單細(xì)胞生物、動(dòng)物組織和器官、蛋白質(zhì)、生物膜、醫(yī)藥制劑等的保護(hù)劑，能夠抑制脂質(zhì)酸化、淀粉老化、蛋白質(zhì)變性，具有矯味矯臭功能、搞玻璃轉(zhuǎn)化溫度、低吸濕性、低甜度等性質(zhì)，能夠?qū)⑵鋺?yīng)用到醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、生化制品業(yè)、化妝品行業(yè)、食品加工業(yè)。

早期商業(yè)化的海藻糖是從酵母中提取的。1990年價(jià)格約700美元/kg，提取率過低，成本過高。1995年日本利用雙酶法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，使得海藻糖價(jià)格由原來的2萬日元/kg大幅降到1997年的280日元/kg。中國2002年首次以雙酶法實(shí)現(xiàn)海藻糖的產(chǎn)業(yè)化，價(jià)格79元/kg。雙酶法以淀粉為原料，在麥芽寡糖基海藻糖水解酶和麥芽寡糖基海藻糖合成酶的作用下生成海藻糖，此法生產(chǎn)工藝復(fù)雜，難以推廣，目前全世界只有幾個(gè)公司能生產(chǎn)。而海藻糖合酶以麥芽糖為底物，一步轉(zhuǎn)化生成海藻糖，是相對經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)方法，但仍有很多問題需要研究解決，其中海藻糖合酶是關(guān)鍵。因此，挖掘適合生產(chǎn)海藻糖的海藻糖合酶對于推動(dòng)海藻糖的大規(guī)模工業(yè)化、降低產(chǎn)業(yè)成本具有重大的意義。

麥芽糖可以通過水解淀粉得到，生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生一定的葡萄糖，工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖使用純的麥芽糖成本過高。海藻糖合酶除了轉(zhuǎn)苷作用外還有微弱的水解反應(yīng)，由此生成副產(chǎn)物葡萄糖。本發(fā)明所使用的來源于Thermobifidafusca YX海藻糖合酶若以工業(yè)級的麥芽糖(含有1％-10％的葡萄糖)為底物，海藻糖合酶酶轉(zhuǎn)化率會(huì)受到一定的影響。本發(fā)明通過定點(diǎn)突變對海藻糖合酶進(jìn)行改造，削弱葡萄糖對酶轉(zhuǎn)化的抑制作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問題是提供一種海藻糖合酶的突變體，其活性中心位點(diǎn)附近氨基酸發(fā)生突變，得到受葡萄糖抑制影響減弱的海藻糖合酶。所述突變體包括含有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)相對于Thermobifidafusca YX海藻糖合酶活性氨基酸殘基的取代。

所述海藻糖合酶的親本的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的Thermobifidafusca YX海藻糖合酶一致(登錄號WP_011291031.1)。

所述突變體是將親本海藻糖合酶的第289位的谷氨酸(Glu)突變?yōu)楦拾彼?Gly)，命名為E289G；或?qū)⒌?95位的組氨酸(His)突變成天冬酰胺(Asn)，所得突變體命名為H295N；或?qū)⒌?44位的甲硫氨酸(Met)突變成賴氨酸(Lys)，所得突變體命名為M344K；或?qū)⒌?67位的甲硫氨酸(Met)突變成亮氨酸(Leu)，所得突變體命名為M367L。