[發明專利]一種用于塞內卡病毒抗體檢測的固相競爭ELISA試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201710771982.8
• 申請日: 2017-08-31
• 公開（公告）號: CN107894508A
• 公開（公告）日: 2018-04-10
• 發明（設計）人: 鄭海學;田宏;楊帆;石正旺;劉華南;張克山;朱紫祥;李丹;曹偉軍;劉永杰
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/532
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司11139
• 代理人: 孫皓晨,馬鑫

1.一種用于塞內卡病毒(Seneca Valleyvirus,SVV)抗體檢測的固相競爭ELISA試劑盒，其特征在于包括塞內卡病毒滅活抗原包被的酶標板以及HRP標記的塞內卡病毒兔抗IgG。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的酶標板按照以下方法制備得到：

(1)SVV滅活抗原的包被

將10^8.50TCID50/ml的SVV滅活抗原用pH7.2的碳酸鹽緩沖液進行1:20的稀釋，之后在ELISA板的每孔加50μl抗原稀釋液，4℃靜置8～12小時；

(2)酶標反應板穩定劑的配制

將5g BSA、10g蔗糖、20g海藻糖，加入到1000ml 0.01mol/L PBS(pH7.4)中輕輕震蕩至溶解，加0.05w/v％Procline300，保存于4℃備用；

(3)酶標反應板的封閉方法

棄去酶標板孔內的抗原稀釋液，加入洗滌液，室溫下振蕩洗滌2分鐘，甩掉洗滌液，用吸水紙吸干并驅除孔內氣泡，同法重復洗滌3次，甩干酶標板；之后按150μl/孔的量加入步驟(2)制備得到的酶標反應板穩定劑，4℃過夜，棄去穩定劑，拍干并置通風廚中吹干酶標板，用鋁箔袋加入干燥劑真空包裝，4℃保存備用。

3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，HRP標記的塞內卡病毒兔抗IgG按照以下方法制備得到：

(1)獲得SVV高免兔血清；

(2)離心去除SVV高免血清的沉淀，之后每10ml血清加入1ml 1mol/L CaCl₂溶液和0.4ml 5w/v％的硫酸葡聚糖溶液，室溫攪拌15分鐘，12000r/min，4℃離心20分鐘，收集上清液；

(3)向步驟(2)得到的上清液中加入等體積飽和硫酸銨溶液，混勻后于4℃靜置4～6小時，離心棄上清，用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀，透析去除硫酸銨；

(4)先用10倍柱體積的0.02mol/L，pH7.0的Na₃PO₃緩沖液洗親和層析柱，然后用注射器以1ml/min速度加入步驟(3)透析后的樣品，再以5～10倍柱體積的Na₃PO₃緩沖液洗滌，最后用2～5倍柱體積的0.1M，pH2.7的Glycine-HCl洗脫，收集洗脫液，4℃透析濃縮，得到高純度SVV兔抗IgG；

(5)HRP標記SVV兔抗IgG的制備

將純化之后的5mg/mL的SVV兔抗IgG 0.3mL與0.1mL過氧化物酶加入1.5mL的EP管中，輕輕吹打混勻，4℃過夜；向混合物中加入40μL的三乙醇胺，混勻，加入50μL的硼氫化鈉，混勻，4℃放置30min。再次加入10μL甘氨酸溶液，混勻，之后將混合液置于透析袋中透析，所用的透析液為pH 7.2的PBS緩沖液。

4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于還包括洗滌液、樣品稀釋液、酶標抗體稀釋液、陽性對照、陰性對照、顯色液以及終止液。

5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的洗滌液是含有5v/v％Tween-20、8w/w％氯化鈉、0.2w/w％氯化鉀、2.9w/w％磷酸氫二鈉和0.2w/w％磷酸二氫鉀的水溶液，pH7.4，使用時稀釋10倍使用；所述的樣品稀釋液是含有5w/w％牛血清白蛋白、5v/v％Tween-20、8w/w％氯化鈉、0.2w/w％氯化鉀、2.9w/w％磷酸氫二鈉和0.2w/w％磷酸二氫鉀的水溶液，pH7.4，使用時稀釋10倍使用；所述的酶標抗體稀釋液是含有1v/v％甘油、0.5w/v％牛血清白蛋白、1w/v％酪蛋白以及0.05w/v％Procline300的0.01mol/L PBS緩沖液，pH7.4；所述的顯色液為ABTS或TMB顯色液；所述的終止液為2mol/L的H₂SO₄溶液；所述的陽性對照為塞內卡病毒陽性血清，所述的陰性對照為塞內卡病毒陰性血清。