[發明專利]一種用于塞內卡病毒抗體檢測的固相競爭ELISA試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201710771982.8
• 申請日: 2017-08-31
• 公開（公告）號: CN107894508A
• 公開（公告）日: 2018-04-10
• 發明（設計）人: 鄭海學;田宏;楊帆;石正旺;劉華南;張克山;朱紫祥;李丹;曹偉軍;劉永杰
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/532
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司11139
• 代理人: 孫皓晨,馬鑫

技術領域

本發明涉及一種病毒檢測試劑盒及其應用，特別涉及基于塞內卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)特異性酶標抗體技術建立SVV固相競爭ELISA抗體檢測試劑盒及其應用。本發明屬于生物檢測技術領域。

背景技術

SVV也被稱為塞內卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)，其對美國豬群來說并不陌生。在過去30年中，共有近20例SVV感染被確認。在美國，SVV通常與特發性豬水皰病有關。在全球范圍內都有SVA的報道，包括加拿大、澳大利亞、意大利、新西蘭和巴西。SVV是一種無囊膜、單鏈RNA病毒，與豬口蹄疫(FMD)和豬水皰病毒一樣，屬小RNA病毒科。它可能是豬特發性水皰病的病原體，但是這種觀點尚未得到證實。

2015年9月，美國某種豬場豬群出現跛足、水泡且伴隨初生仔豬死亡，PCR檢測排除FMDV、PDCoV、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、A/B/C型豬輪狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬呼吸與繁殖綜合癥病毒(PRRSV)的感染，發病豬的血清、皮膚、糞便、蹄部冠狀帶的PCR檢測結果顯示為SVV陽性，并通過豬睪丸細胞(ST細胞)分離得到SVV。

2015年3月，我國廣東某豬場超期斷奶豬被發現跛行，將發情母豬趕去配種舍定位欄沖洗干凈后，發現一頭豬出現鼻鏡水泡，送檢水泡液、水泡皮、腳皮樣品，檢測結果顯示口蹄疫、豬水皰病病原檢測均陰性而豬場的發病仍在擴大，最終通過對病料進行多種病原的檢測送測序后獲得一段序列，經與基因數據庫比對，發現與SVV序列的相似性最高，繼而查找資料，確定發病豬群感染SVV，并分離到SVV細胞株。隨后在2015年10月、11月及2016年1月、2月陸續在其他豬場發現豬群感染SVV病例，而且一直呈現上升趨勢。

由于SVV感染動物所引起的癥狀與其他病毒性疾病如口蹄疫、水泡性口炎病、豬水皰病臨床表現十分相似，給臨床確診帶來了難度。因此，需要實驗室技術加以確定。目前主要包括病毒分離、抗體檢測和抗原檢測等。抗體檢測方法主要包括血清中和試驗(特異性高，廣泛應用于血清學調查)和ELISA法(適用于豬血清大規模普查)。病原學檢測方法主要是免疫組化試驗，該方法是抗原檢測敏感且特異的方法，主要體現在能定位病原在組織細胞中的分布。RT-PCR技術通常具有特異性高、可靠、快速，廣泛應用于分子生物學檢測。目前應用于SVV診斷的檢測方法程序繁多、操作步驟復雜，檢測至少需要一天的時間才能獲得結果，因此在疫情突發時無法實現大量的樣品的即時檢測。要克服現狀就必須研制新型ELISA診斷技術，本發明所涉及的檢測方法是以輕簡化或精準為目標的新型定性定量技術。

另外，鑒于目前國內外尚未有血清學診斷方法的報道，唯一能檢測抗體的方法為病毒中和實驗(VNT)，本方法屬于首創SVV抗體檢測的ELISA試劑盒，相對于VNT而言，本發明具有簡便、敏感、穩定及省時等特點，為SVV抗體檢測提供了一種有效的技術手段。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于塞內卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)抗體檢測的固相競爭ELISA試劑盒及其應用。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：

本發明的一種用于塞內卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)抗體檢測的固相競爭ELISA試劑盒，包括塞內卡病毒滅活抗原包被的酶標板以及HRP標記的塞內卡病毒兔抗IgG。

在本發明中，優選的，所述的酶標板按照以下方法制備得到：

(1)SVV滅活抗原的包被

將10^8.50TCID50/ml的SVV滅活抗原用pH7.2的碳酸鹽緩沖液進行1:20的稀釋，之后在ELISA板的每孔加50μl抗原稀釋液，4℃靜置8～12小時；

(2)酶標反應板穩定劑的配制

將5g BSA、10g蔗糖、20g海藻糖，加入到1000ml 0.01mol/L PBS(pH7.4)中輕輕震蕩至溶解，加0.05w/v％Procline300，保存于4℃備用；

(3)酶標反應板的封閉方法

棄去酶標板孔內的抗原稀釋液，加入PBST洗滌液，室溫下振蕩洗滌2分鐘，甩掉洗滌液，用吸水紙吸干并驅除孔內氣泡，同法重復洗滌3次，甩干酶標板；之后按150μl/孔的量加入步驟(2)制備得到的酶標反應板穩定劑，4℃過夜，棄去穩定劑，拍干并置通風廚中吹干酶標板，用鋁箔袋加入干燥劑真空包裝，4℃保存備用。

在本發明中，優選的，HRP標記的塞內卡病毒兔抗IgG按照以下方法制備得到：