[發明專利]一種細胞中內源性表達RNA聚合酶的核酸構建物

有效

• 申請號: 201710768550.1
• 申請日: 2017-08-31
• 公開（公告）號: CN109423496B
• 公開（公告）日: 2023-09-15
• 發明（設計）人: 郭敏;代田純;薛銀鴿;李海洋;王海鵬;柴智;劉帥龍;于雪
• 申請（專利權）人: 康碼（上海）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12R1/645
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本發明提供了一種細胞中內源性表達RNA聚合酶的核酸構建物，具體地，發現了一種可大幅度增強蛋白質翻譯效率的新型核酸構建物，本發明的核酸構建物由具有特定啟動強度的啟動子（如RNR2、ADH1、GAPDH、TEF1、PGK1、SED1等）和RNAP（如T7RNAP、T3RNAP、T4RNAP、T5RNAP等）蛋白的編碼序列構成，在酵母體外蛋白質合成體系中應用本發明的核酸構建物，所合成的熒光素酶活性的相對光單位值（RLU）非常高，可達到與外源加入T7RNAP相同效果?？筛哌_6.6×10supgt;7/supgt;。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，較佳地，涉及一種細胞中內源性表達?RNA?聚合酶的核酸構建物。

背景技術

RNA聚合酶是一種RNA聚合酶（RNA?polymerase）：以一條DNA鏈或RNA為模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶，是催化以DNA為模板（template）、三磷酸核糖核苷為底物、通過磷酸二酯鍵而聚合的合成RNA的酶，因為在細胞內與基因DNA的遺傳信息轉錄為RNA有關，所以也稱轉錄酶。

T7?RNA?聚合酶（T7?RNAP）是來源于T7噬菌體的一種RNA?聚合酶，識別23?nt的保守啟動子序列（pT7）并提供較強的轉錄活性。T7?RNAP廣泛應用于大腸桿菌（ Escherichia?coli）等原核生物中外源基因的表達，在真核生物中也有成功應用的報。在酵母系統中，將T7?RNAP在釀酒酵母（ Saccharomyces?cerevisiae）或者畢赤酵母（ Pichia?pastoris）中表達時，均能實現靶基因的高效轉錄，雖然其轉錄產物并不能被有效翻譯成蛋白質。目前，無論是大腸桿菌（DE3?質粒）還是酵母（2μ?質粒）中，T7?RNAP均是以外源質粒的方式存在于細胞中的，尚無直接重組至其基因組中穩定高效率表達T7?RNAP的細胞系統。

蛋白質體外合成系統是指在細菌、真菌、植物細胞或動物細胞的裂解體系中，加入mRNA或者DNA模板、RNA聚合酶及氨基酸和ATP等組分，完成外源蛋白的快速高效翻譯。目前，經常實驗的商業化體外蛋白表達系統包括大腸桿菌系統（ E.coli?extract，ECE）、兔網織紅細胞（Rabbit?reticulocyte?Lysate，RRL）、麥胚（Wheat?germ?extract,?WGE）、昆蟲（Insect?cell?extract,?ICE）和人源系統。

克魯維酵母（ Kluyveromyces）是一種子囊孢子酵母，其中的馬克斯克魯維酵母（ Kluyveromyces?marxianus）和乳酸克魯維酵母（ Kluyveromyces?lactis）是工業上廣泛使用的酵母。例如乳酸克魯維酵母是一種能夠以乳酸作為其唯一的碳源和能源的酵母。與其他酵母相比，乳酸克魯維酵母具有許多優點，如超強的分泌能力，良好的大規模發酵特性、食品安全的級別及同時具有蛋白翻譯后修飾的能力等，其作為宿主系統表達藥用蛋白也已顯示出巨大的潛力。