[發明專利]一種蝦蟹類富水性組織的石蠟切片制作方法

有效

• 申請號: 201710768140.7
• 申請日: 2017-08-31
• 公開（公告）號: CN107389412B
• 公開（公告）日: 2019-10-22
• 發明（設計）人: 王慧;朱鵬;孫姚佳代
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 高強

1.一種蝦蟹類組織的石蠟切片方法，其特征在于步驟如下：

1）將樣品組織放于組織固定液中，立即負壓固定，負壓至樣品組織塊膨脹飽滿、不再產生氣泡；再立即加入到盛有相同濃度的組織固定液的適宜體積的離心管中，離心管中組織固定液的量與樣品組織體積之比為20：1；避免組織塊貼于容器壁上，室溫恒溫固定4-6h；所述負壓的壓力值為-1.25kpa；負壓容器總容積：容器中組織固定液總體積:樣品組織體積=6:3:1；

所述組織固定液為溶質質量分數2.5%的多聚甲醛溶液；多聚甲醛溶液具體制備方法為：取多聚甲醛50g，1×PBS緩沖溶液900ml，加水至1000ml，混合后60℃下水浴24h，若還有未溶解的多聚甲醛，滴加1-2滴1當量（1mol/L）的NaOH溶液，調節PH為6.8-7.2，4℃下保存；

0.01M所述1×PBS緩沖溶液的組份為：Na₂HPO₄ 8mM，NaCl 136mM，KH₂PO₄ 2mM，KCl2.6mM，PH=7.2-7.4；

所述1當量的NaOH溶液為：稱取NaOH固體粉末10g，用250mL的容量瓶配置成250mL 、1mol/L的NaOH溶液；

2） 將步驟1）固定后的樣品組織放入包埋盒中，用流動清水不間斷流動沖洗包埋盒24h；洗除樣品組織中殘留的固定液；

3）對沖洗完畢的樣品組織在常溫下，依次用梯度濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液脫水處理；濃度為30%的乙醇溶液脫水處理時間分別為4h-5h；濃度為40%、50%、60%、70%的乙醇溶液脫水處理時間分別為40min-1h，濃度為80%、90%、100%的乙醇脫水處理時間分別為15min-35min；當乙醇溶液濃度≤70%時，所述乙醇溶液與樣品組織的體積比為50:1；當乙醇溶液濃度濃度≥70%時，所述乙醇溶液與樣品組織的體積比為35:1；脫水處理完成后將裝有樣品組織的包埋盒從無水乙醇溶液中取出；

所述組織脫水步驟為：

a）25℃，30％濃度的乙醇中持續處理4h；

b）25℃，40％濃度的乙醇中持續處理40min；

c）25℃，50%濃度的乙醇中持續處理40min；

d）25℃，60%濃度的乙醇中持續處理40min；

e）25℃，70％濃度的乙醇中持續處理40min；

f）25℃，80％濃度的乙醇中持續處理40min；

g）25℃，90％濃度的乙醇中持續處理40min；

h）25℃，95％濃度的乙醇中持續處理40min；

i）25℃，100％濃度的乙醇中持續處理(Ⅰ)15min；

j）25℃，100％濃度的乙醇中持續處理(Ⅱ)15min；

4） 將步驟3）中取出的包埋盒放入透明劑中進行透明處理；

所述透明劑為溶質質量分數為50%的二甲苯Ⅰ溶液、溶質質量分數為95%的二甲苯Ⅱ溶液；

透明處理步驟如下：

a）甩凈殘余包埋盒無水乙醇溶液，以懸空重力作用30s后無乙醇溶液液滴滴下為標準；

b）將包埋盒先放入二甲苯Ⅰ溶液中40min后再放入二甲苯Ⅱ溶液中30min；

5）把透明好的樣品組織放入蠟槽，60℃下滲蠟1h；滲蠟完成后運用金屬包埋器進行包埋，待完全冷卻凝固后將包埋器去掉；

6）扭緊固定好切片機機頭，穩固刀架結構，調整切片厚度為5μm；首先進行切片的預實驗修整，直至切出完整的最大組織切面后，再進行正式切制；將切片平整鋪開，輕拖使其單層鋪于展片機的恒溫水體表層；自然晾干12h，100℃烤箱中烘烤2h；

所述預實驗修整分三步進行：一是切平面，每一刀切出的切片都是5μm均勻厚度的單片組織切片，避免出現厚度不均；二是切大小，每一刀切出的切片的橫截面形狀和面積相似；三是切微觀組織，通過將切片不斷在顯微鏡下進行觀察，保證切出的切片微觀組織既要滿足橫切、縱切的要求，同時清晰可見；

7）將烘干后的切片用二甲苯溶液進行脫蠟處理，脫蠟完成后用100%、95%、90%、80%、70%、60%的濃度梯度乙醇溶液和伊紅-蘇木精染液進行染色處理；最后，用中性樹膠將染色完成的切片進行封片處理，并用恒溫箱將封好的切片作干燥處理；

所述脫蠟步驟為：取已經干燥的切片，放于盛有溶質質量分數為95%的二甲苯Ⅱ溶液中脫蠟10min；

染色處理步驟如下：

a）25℃，100％乙醇溶液持續處理10min；

b）25℃，95％乙醇溶液持續處理10min；

c）25℃，90％乙醇溶液持續處理10min；

d）25℃，80％乙醇溶液持續處理10min；

e）25℃，70％乙醇溶液持續處理10min；

f）25℃，60％乙醇溶液持續處理10min；

g）25℃，蒸餾水持續處理5min，4℃冷卻3min；

h）25℃，蘇木紫染液持續處理10min，4℃冷卻3min；

i）25℃，蒸餾水輕沾1-2次，4℃冷卻1-2min；

j）25℃，分色液持續處理5s，4℃冷卻10s；11）25℃，去離子水輕沾1-2次，4℃冷卻3min；所述分色液組分為：溶質質量分數70％的酒精100ml和鹽酸 1ml；

k）25℃，伊紅染液持續處理1min，4℃冷卻10s；

l）25℃，90%乙醇溶液持續處理2min；

m）25℃，95%乙醇溶液持續處理2min；

n）25℃，100%乙醇溶液持續處理10min；

o）25℃，溶質質量分數為50%的二甲苯Ⅰ溶液持續處理10min；

p）25℃，溶質質量分數為50%的二甲苯Ⅱ溶液持續處理10min。