[發(fā)明專利]磁珠偶聯(lián)多種刺激蛋白的體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710767822.6
• 申請日: 2017-08-31
• 公開（公告）號: CN107354133B
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃昕華;徐峰波;劉倩;龐勇;張晉偉
• 申請（專利權(quán)）人: 銀豐生物工程集團(tuán)有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 山東舜天律師事務(wù)所 37226
• 代理人: 李新海

本發(fā)明公開了磁珠偶聯(lián)多種刺激蛋白的體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法：采用NK細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)NK細(xì)胞，并加入偶聯(lián)了IL?15、4?1BBligand和IL?21的磁珠(三者摩爾比為1～3:1～3:1～3)，培養(yǎng)12～15天，收獲洗滌NK細(xì)胞；所述NK細(xì)胞培養(yǎng)基，是由以下方法制備得到的：在X?VIVO 20基本培養(yǎng)基中添加10％的human AB血清或自體血清，500IU/mL的IL?2，5ng/ml的IL?15，即得。本發(fā)明的方法用磁珠偶聯(lián)3個特異性刺激性因子，既達(dá)到多因子刺激NK細(xì)胞的目的，又避免了使用滋養(yǎng)層細(xì)胞株，從而兼顧GMP生產(chǎn)的要求和擴(kuò)增效率的要求，所收獲的NK細(xì)胞可用于異體移植NK。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及磁珠偶聯(lián)多種刺激蛋白的體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法及應(yīng)用，屬于新型腫瘤免疫治療領(lǐng)域

背景技術(shù)

NK細(xì)胞是一群不同于T、B淋巴細(xì)胞的大顆粒淋巴細(xì)胞，是先天免疫系統(tǒng)的一部分，能識別與溶解腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞，以及產(chǎn)生調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，是人體抗感染和防止腫瘤細(xì)胞生長的重要免疫細(xì)胞。一般將人體內(nèi)CD3-CD56+淋巴細(xì)胞認(rèn)定為NK細(xì)胞，而根據(jù)細(xì)胞上CD56分子表達(dá)密度的差異，將NK細(xì)胞分為CD56dim和CD56bright兩個亞群。CD56dim占NK細(xì)胞90％以上，主要為細(xì)胞毒作用，具有更強(qiáng)的殺傷活性；CD56bright可產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，主要起免疫調(diào)節(jié)作用。

NK不同于T細(xì)胞和B細(xì)胞，缺少基因重排，不像T細(xì)胞、B細(xì)胞一樣通過特異性TCR識別靶細(xì)胞，而是通過胚系基因表達(dá)的受體識別靶細(xì)胞。

NK細(xì)胞受細(xì)胞表面多種受體調(diào)控：殺傷細(xì)胞活化受體(KAR)和殺傷細(xì)胞抑制受體(KIR)。正常情況下，KAR與自身細(xì)胞上多糖類抗原結(jié)合產(chǎn)生活化信號，同時KIR與MHCI類分子結(jié)合，產(chǎn)生抑制信號且占主導(dǎo)地位，以保證自身組織細(xì)胞不被破壞；當(dāng)細(xì)胞表面MHCI類分子發(fā)生改變或減少缺失，影響與KIR結(jié)合，不能產(chǎn)生抑制性信號，NK則活化，產(chǎn)生殺傷效應(yīng)。

NK細(xì)胞的殺傷機(jī)理有：釋放穿孔素和顆粒酶等細(xì)胞毒性顆粒，裂解腫瘤細(xì)胞；活化NK細(xì)胞表達(dá)Fas(CD95)配體和TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand)分子，誘導(dǎo)靶細(xì)胞進(jìn)入程序死亡；NK分泌多種細(xì)胞因子介導(dǎo)殺傷作用；ADCC作用。

基于NK強(qiáng)大的腫瘤細(xì)胞殺傷活性，人們認(rèn)為NK細(xì)胞是免疫監(jiān)視的重要細(xì)胞。活化NK細(xì)胞治療難治/復(fù)發(fā)的急性髓性白血病(AML)，50％以上病例可達(dá)完全緩解，預(yù)期2年無病生存率超過30％。目前，在美國NK細(xì)胞臨床試驗研究多達(dá)800多項，用于多種實體瘤的治療。目前單就NIH注冊的NK細(xì)胞治療淋巴瘤臨床試驗已有20余項，部分使用細(xì)胞多來源于患者家屬，HLA配型單配子相合者。也有使用自體NK細(xì)胞系治療淋巴瘤及其它實體瘤的臨床報告，部分病例有效。在腫瘤免疫治療中，NK細(xì)胞的主要功能通過以下途徑發(fā)揮：用免疫檢查點抑制劑，解除NK細(xì)胞的抑制信號；激活NK細(xì)胞活性功能；抗體通過NK的ADCC殺傷腫瘤細(xì)胞；NK細(xì)胞治療。

目前在CAR-T免疫療法領(lǐng)域，主流的都是以T細(xì)胞為核心，對血液腫瘤有顯著療效的同時，CAR-T治療也存在著一些問題，比如脫靶效應(yīng)、細(xì)胞因子風(fēng)暴，并且對實體瘤暫時未取得顯著療效。NK細(xì)胞因其特殊的識別靶細(xì)胞的機(jī)制、短暫的生理周期、廣泛的腫瘤殺傷能力等優(yōu)勢，有可能成為CAR修飾的效應(yīng)細(xì)胞(car NK)。NK細(xì)胞能在體外增殖最高到1000倍，是腫瘤免疫細(xì)胞治療的理想載體。

目前市場上培養(yǎng)NK細(xì)胞的方案，主要是基本培養(yǎng)基，加生長刺激(抗CD16單抗，抗CD52單抗，IL2，IL15等)，技術(shù)要點及存在的不足之處如下：

1、加可溶性生長因子IL2，IL15，缺點是擴(kuò)增倍數(shù)有限；

2、加生長因子或單抗包被培養(yǎng)瓶底部，缺點是擴(kuò)增倍數(shù)有限，操作不便；

3、利用滋養(yǎng)層細(xì)胞(Feeder Cell)K562-IL15-4-1BBligand等，伽馬輻射后使用，缺點是不符合GMP標(biāo)準(zhǔn)。