[發明專利]磁珠偶聯多種刺激蛋白的體外擴增NK細胞的方法及應用

有效

• 申請號: 201710767822.6
• 申請日: 2017-08-31
• 公開（公告）號: CN107354133B
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 黃昕華;徐峰波;劉倩;龐勇;張晉偉
• 申請（專利權）人: 銀豐生物工程集團有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 山東舜天律師事務所 37226
• 代理人: 李新海

本發明公開了磁珠偶聯多種刺激蛋白的體外擴增NK細胞的方法：采用NK細胞培養基培養NK細胞，并加入偶聯了IL?15、4?1BBligand和IL?21的磁珠(三者摩爾比為1～3:1～3:1～3)，培養12～15天，收獲洗滌NK細胞；所述NK細胞培養基，是由以下方法制備得到的：在X?VIVO 20基本培養基中添加10％的human AB血清或自體血清，500IU/mL的IL?2，5ng/ml的IL?15，即得。本發明的方法用磁珠偶聯3個特異性刺激性因子，既達到多因子刺激NK細胞的目的，又避免了使用滋養層細胞株，從而兼顧GMP生產的要求和擴增效率的要求，所收獲的NK細胞可用于異體移植NK。

技術領域

本發明涉及磁珠偶聯多種刺激蛋白的體外擴增NK細胞的方法及應用，屬于新型腫瘤免疫治療領域

背景技術

NK細胞是一群不同于T、B淋巴細胞的大顆粒淋巴細胞，是先天免疫系統的一部分，能識別與溶解腫瘤細胞和病毒感染細胞，以及產生調節性細胞因子，是人體抗感染和防止腫瘤細胞生長的重要免疫細胞。一般將人體內CD3-CD56+淋巴細胞認定為NK細胞，而根據細胞上CD56分子表達密度的差異，將NK細胞分為CD56dim和CD56bright兩個亞群。CD56dim占NK細胞90％以上，主要為細胞毒作用，具有更強的殺傷活性；CD56bright可產生大量細胞因子，主要起免疫調節作用。

NK不同于T細胞和B細胞，缺少基因重排，不像T細胞、B細胞一樣通過特異性TCR識別靶細胞，而是通過胚系基因表達的受體識別靶細胞。

NK細胞受細胞表面多種受體調控：殺傷細胞活化受體(KAR)和殺傷細胞抑制受體(KIR)。正常情況下，KAR與自身細胞上多糖類抗原結合產生活化信號，同時KIR與MHCI類分子結合，產生抑制信號且占主導地位，以保證自身組織細胞不被破壞；當細胞表面MHCI類分子發生改變或減少缺失，影響與KIR結合，不能產生抑制性信號，NK則活化，產生殺傷效應。

NK細胞的殺傷機理有：釋放穿孔素和顆粒酶等細胞毒性顆粒，裂解腫瘤細胞；活化NK細胞表達Fas(CD95)配體和TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand)分子，誘導靶細胞進入程序死亡；NK分泌多種細胞因子介導殺傷作用；ADCC作用。

基于NK強大的腫瘤細胞殺傷活性，人們認為NK細胞是免疫監視的重要細胞。活化NK細胞治療難治/復發的急性髓性白血病(AML)，50％以上病例可達完全緩解，預期2年無病生存率超過30％。目前，在美國NK細胞臨床試驗研究多達800多項，用于多種實體瘤的治療。目前單就NIH注冊的NK細胞治療淋巴瘤臨床試驗已有20余項，部分使用細胞多來源于患者家屬，HLA配型單配子相合者。也有使用自體NK細胞系治療淋巴瘤及其它實體瘤的臨床報告，部分病例有效。在腫瘤免疫治療中，NK細胞的主要功能通過以下途徑發揮：用免疫檢查點抑制劑，解除NK細胞的抑制信號；激活NK細胞活性功能；抗體通過NK的ADCC殺傷腫瘤細胞；NK細胞治療。

目前在CAR-T免疫療法領域，主流的都是以T細胞為核心，對血液腫瘤有顯著療效的同時，CAR-T治療也存在著一些問題，比如脫靶效應、細胞因子風暴，并且對實體瘤暫時未取得顯著療效。NK細胞因其特殊的識別靶細胞的機制、短暫的生理周期、廣泛的腫瘤殺傷能力等優勢，有可能成為CAR修飾的效應細胞(car NK)。NK細胞能在體外增殖最高到1000倍，是腫瘤免疫細胞治療的理想載體。

目前市場上培養NK細胞的方案，主要是基本培養基，加生長刺激(抗CD16單抗，抗CD52單抗，IL2，IL15等)，技術要點及存在的不足之處如下：

1、加可溶性生長因子IL2，IL15，缺點是擴增倍數有限；

2、加生長因子或單抗包被培養瓶底部，缺點是擴增倍數有限，操作不便；

3、利用滋養層細胞(Feeder Cell)K562-IL15-4-1BBligand等，伽馬輻射后使用，缺點是不符合GMP標準。