[發明專利]磁珠偶聯多種刺激蛋白的體外擴增NK細胞的方法及應用

有效

• 申請號: 201710767822.6
• 申請日: 2017-08-31
• 公開（公告）號: CN107354133B
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 黃昕華;徐峰波;劉倩;龐勇;張晉偉
• 申請（專利權）人: 銀豐生物工程集團有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 山東舜天律師事務所 37226
• 代理人: 李新海

1.磁珠偶聯多種刺激蛋白的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于：采用NK細胞培養基培養NK細胞，并加入偶聯了IL-15、4-1BBligand和IL-21的磁珠，磁珠與初始NK細胞的數量比為3:1，共培養12～15天；培養后，收獲、洗滌NK細胞，磁鐵吸附去除磁珠；

所述NK細胞培養基，是由以下方法制備得到的：在X-VIVO 20基本培養基中添加10％的human AB血清或自體血清，終濃度為500IU/mL的IL-2，終濃度為5ng/ml的IL-15，即得；

所述偶聯了IL-15、4-1BBligand和IL-21的磁珠上，IL-15、4-1BBligand和IL-21的摩爾比為2:1:3；

所述采用NK細胞培養基培養NK細胞時，初始單個核細胞的細胞密度為1×10⁶cells/ml；

所述培養12～15天期間的培養條件為：37℃，5％CO₂，培養過程中每三天進行一次半量換液；

所述IL-15、4-1BBligand和IL-21，是通過基因工程表達、純化得到的：在ecoli表達質粒中，克隆IL-15，4-1BBligand，IL-21cDNA到GST-7xHis-TEV site的下游，IL15在大腸桿菌表達的序列如SEQ ID NO.1所示；4-1BB ligand在大腸桿菌表達的序列如SEQ ID NO.2所示；IL21在大腸桿菌表達的序列如SEQ ID NO.3所示，經過表達和純化，經過TEV蛋白酶切獲取高純度的IL-15，4-1BBligand，IL-21蛋白；

所述偶聯了IL-15、4-1BBligand和IL-21的磁珠上的所結合的生長因子總量為磁珠的最大飽和結合量；

所述偶聯了IL-15、4-1BBligand和IL-21的磁珠的制備方法為：取表面功能基團為-NH2的磁珠，與含有IL-15、4-1BBligand和IL-21的混合液室溫混合,即得；其中，混合液中，IL-15、4-1BBligand和IL-21的摩爾比為2:1:3；所述混合液中IL-15、4-1BBligand和IL-21的蛋白濃度分別為0.22mg/mL，0.20mg/mL和0.46mg/mL。

2.根據權利要求1所述的磁珠偶聯多種刺激蛋白的體外擴增NK細胞的方法，其特征在于：所述混合時間為1小時。