[發(fā)明專利]一種對(duì)胃蛋白酶抗性提高的纖維素酶酶E4及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710763368.7
• 申請(qǐng)日: 2017-08-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107674867B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚冬生;王英;謝春芳;劉大嶺
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 暨南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/42
• 分類號(hào): C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;A23L29/00;A23K20/189
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 劉宇峰

本發(fā)明公開(kāi)了一種對(duì)胃蛋白酶抗性提高的纖維素酶E4。本發(fā)明所述的一種定點(diǎn)突變改造的纖維素酶E4是由氨基酸序列為SEQ ID NO.1的來(lái)源于褐色熱單胞桿菌(Thermonospora fusca)的纖維素酶E4中制造多個(gè)氨基酸取代而產(chǎn)生的、對(duì)胃蛋白酶抗性更強(qiáng)的纖維素分解酶，所述的氨基酸取代是第691位和第800位的取代。本發(fā)明所述的纖維素酶E4不僅依然對(duì)纖維素具有催化功能，而且提高了其對(duì)胃蛋白酶的耐受性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種纖維素酶胃蛋白酶E4，特別是一種對(duì)胃蛋白酶抗性提高的纖維素酶E4。

背景技術(shù)

纖維素酶是指能降解纖維素的一類酶的總稱，是一個(gè)由多種水解酶組成的復(fù)雜酶系，主要來(lái)自于真菌和細(xì)菌。根據(jù)各酶功能的不同主要分為三類：(1)葡聚糖內(nèi)切酶(1,4-β-D-glucan glucanohydrolase，EC.3.2.1.4)，來(lái)自于真菌簡(jiǎn)稱為EG；來(lái)自于細(xì)菌簡(jiǎn)稱成為L(zhǎng)en，這類酶一般作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1,4糖苷鍵，將長(zhǎng)鏈纖維素分子截?cái)啵a(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分子纖維素；(2)葡聚糖外切酶(1,4-β-D-glucancellobihydrolase，EC.3.2.1.91)，來(lái)自于真菌簡(jiǎn)稱為Cbh；來(lái)自于細(xì)菌簡(jiǎn)稱成為Cex，這類酶作用于纖維素線性分子末端，水解β-1,4糖苷鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖分子，故又稱為纖維二糖水解酶 (cellobiohydrolase)；(3)β-葡聚糖苷酶(β-1,4-glucosidase，E.C3.2.1.21，簡(jiǎn)稱BG)，這類酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子。

作為纖維素酶的重要組成部分纖維素酶E4，它是由褐色熱單胞菌(Thermomonospora fusca)產(chǎn)生的，T.fusca是一種生存在土壤中的嗜熱的絲狀放線菌，其產(chǎn)生6種結(jié)構(gòu)和功能各有特點(diǎn)的纖維素酶。包括：兩種外切纖維素酶，三種內(nèi)切纖維素酶，褐色熱單胞菌產(chǎn)生的另外一種，也是最為獨(dú)特的一種纖維素酶為Cel9A(ex-E4)，它同時(shí)表現(xiàn)出內(nèi)切酶和外切酶的共同的活性，具有較高的研究利用價(jià)值，因此也是飼用酶制劑中纖維素用酶的首選。

我國(guó)配合飼料中除一般玉米-豆粕型日糧，還有在玉米-豆粕型日糧基礎(chǔ)上加入10％-40％的大麥或小麥、次粉、麥麩、統(tǒng)糠、棉粕等非常規(guī)飼料原料，這使得飼料中非淀粉多糖(NSP)和植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子增多降低了畜禽對(duì)飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收及利用，影響畜禽健康和生產(chǎn)性能。因此飼用酶制劑在飼料工業(yè)中占有重要地位。另外，外國(guó)低價(jià)格小麥、大麥產(chǎn)品的涌入，將進(jìn)一步刺激飼用酶制劑的市場(chǎng)需求。目前，飼用酶制劑在世界各國(guó)廣泛應(yīng)用于豬、家禽、反芻動(dòng)物、水產(chǎn)動(dòng)物的飼糧中。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)微生物發(fā)酵方法可大量人工制成各種酶制劑，為其在飼料工業(yè)中大規(guī)模應(yīng)用提供了保障。

麥類日糧中各種植物性飼料原料都由無(wú)數(shù)植物細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞的細(xì)胞壁包裹著淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。細(xì)胞壁主要由纖維素，半纖維素、果膠和木質(zhì)素等構(gòu)成，飼料粉碎工序難以破壞細(xì)胞壁。單胃動(dòng)物消化酶液無(wú)法消化細(xì)胞壁物質(zhì)，而NSP酶降解細(xì)胞壁中的細(xì)胞壁物質(zhì)，使細(xì)胞壁崩解，釋放出被細(xì)胞壁包裹的養(yǎng)分，為動(dòng)物所利用。作為NSP酶中重要組成部分纖維素酶發(fā)揮著重要作用。

飼料用酶是在進(jìn)入養(yǎng)殖動(dòng)物消化道之后發(fā)揮作用的，它本身作為一種具有生物活性的蛋白，其發(fā)揮作用受到動(dòng)物消化道環(huán)境的影響，而胃中較低的pH值可能對(duì)酶的活性有很大影響，降低了酶制劑的使用效率。因此獲得具有蛋白酶抗性的酶制劑很有必要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的首要目的是提供一種對(duì)胃蛋白酶抗性提高的纖維素酶E4。

本發(fā)明是對(duì)纖維素酶E4的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變。由褐色熱單胞桿菌(Thermonospora fusca)中獲得得纖維素酶E4已經(jīng)被測(cè)序。GenBank登錄號(hào)為 L20093.1，長(zhǎng)度為2502bp，編碼834個(gè)氨基酸殘基。