[發明專利]一種GP73 C端抗原的制備及其應用

有效

• 申請號: 201710757834.0
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN107746430B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 馬茂森;孟超;關素梅;張旭;李保芬;毛茹倩;杜曉丹;周晶金
• 申請（專利權）人: 天津金虹生物科技開發有限公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/70;C07K16/18;C12N5/20;G01N33/577
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產權代理有限公司 12211
• 代理人: 孫曉鳳

1.一種GP73 C端蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。

2.一種制備如權利要求1所述的GP73 C端蛋白的方法，其特征在于，首先，采用PCR方法擴增出編碼表達GP73 C端的DNA序列；然后，將該序列插入到表達載體的多克隆位點，構建重組表達質粒；之后，轉化到表達宿主菌，構建得到工程菌株，工程菌株經誘導表達；最后，分離純化得到GP73C端重組蛋白。

3.根據權利要求2所述的一種GP73 C端蛋白的制備方法，其特征在于，主要包括如下步驟：

(1)PCR擴增：采用含BamHI、EcoRI酶切位點的引物PCR擴增GP73C端基因，所述GP73C端基因為從1019～1336bp的基因，酶切純化后與經BamHI、EcoRI酶切后的PGEX-4T-2質粒連接，轉化入大腸桿菌BL21；

(2)確定表達形式：隨機挑選陽性克隆，25℃采用1％異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)化學誘導，1％NP-40裂解，-80℃反復凍融3次，離心，取上清和沉淀分別進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定，確定表達形式；

(3)擴大培養及純化：選取陽性克隆進行擴大培養，1％NP-40裂解，-80℃反復凍融3次，采用層析法純化GP73C端抗原。

4.根據權利要求3所述的一種GP73 C端蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(1)中的上游引物為5’-3’：GC GCT GGA TCC CAG CTG GCC TCA，下游引物為5’-3’：GC GAA TTC TGATGTGAG ATGATT。

5.一種應用如權利要求1所述的GP73 C端蛋白制備單克隆抗體方法，其特征在于，用表達合成的GP73C端重組蛋白免疫Balb/C小鼠制備并篩選雜交瘤細胞株，制備腹水并純化單克隆抗體。

6.權利要求5中制備得到的單克隆抗體在制備診斷肝臟疾病試劑中的應用。

7.權利要求5中制備得到的單克隆抗體在制備診斷肝臟疾病試劑盒中的應用。

8.如權利要求7中的試劑盒，其特征在于，該試劑盒的檢測過程包括單克隆抗體通過ELISA法檢測血清中GP73含量/巖藻糖基化GP73含量的過程。

9.如權利要求7中的試劑盒，其特征在于，該試劑盒的檢測過程包括單克隆抗體通過磁珠化學發光法檢測GP73含量試劑盒方面的過程。

10.如權利要求8中的試劑盒，其特征在于，ELISA法檢測血清中GP73含量的過程，為用兩株針對GP73 C端蛋白不同表位的單克隆抗體分別作為包被抗體和檢測抗體，通過底物顯色檢測GP73蛋白，通過校準品制備的標準曲線確定GP73蛋白的含量。