[發明專利]一種治療流感嗜血桿菌感染的血清的制備方法及該血清的應用

有效

• 申請號: 201710757354.4
• 申請日: 2017-08-29
• 公開（公告）號: CN107586334B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 孫愛華;嚴杰;王榮山;金洪星;黃燕穎
• 申請（專利權）人: 杭州醫學院
• 主分類號: C07K16/06
• 分類號: C07K16/06;C07K16/12;C12N15/70;A61K39/40;A61P31/04
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 沈淵琪

一種治療流感嗜血桿菌感染的血清的制備方法及該血清的應用，屬于生物技術領域。該方法包括：抗原表位融合片段的構建；串聯表位融合片段的構建；串聯式目的表位基因原核表達；目的重組融合蛋白水解和提純；多抗原MAP交聯肽制備；免疫獲得血清。本發明將抗原優勢表位融合后并串聯后的重組表達蛋白與高分子核心基質交聯形成MAP?rHap?C4?GGGS?Hap?C150。不僅能保證抗原的免疫原性及其免疫機體后產生抗體的殺菌能力且能提高抗原制備效率，為大量抗體制備提供足夠的抗原。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種治療流感嗜血桿菌感染的血清的制備方法及該血清的應用。

背景技術

流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，Hi）為寄生于人鼻咽部及上呼吸道的革蘭陰性小桿菌，呼吸道為主要入侵門戶，可引起全身多部位的感染。局部感染可引起中耳炎、鼻竇炎、會厭炎和皮膚軟組織感染等。全身感染可導致肺炎、腦膜炎、心內膜炎、骨髓炎、化膿性骨關節炎、泌尿生殖道感染等。是嬰幼兒腦膜炎、肺炎和急性中耳炎等感染性疾病的主要病原體。流感嗜血桿菌可分為莢膜型和無莢膜型，前者可用莢膜抗體分為6個血清型，分別命名為Hia、Hib、Hic、Hid、Hie、Hif；無莢膜型無法用莢膜多糖抗體分型，故稱無莢膜型Hi又稱為不可分型流感嗜血桿菌（nontypeable H. influenzae，NTHi）。

阻止Hi黏附定植，減少細菌微菌落的形成是防治流感嗜血桿菌感染的關鍵，已有的研究顯示Hap蛋白不僅是位于流感嗜血桿菌外膜的黏附因子，NTHi和THi均有表達，同時還可誘導機體產生具有免疫保護作用的黏膜S-IgA和血清IgG，能阻止NTHi在呼吸道的黏附定植, 減少細菌微菌落的形成，因此Hap 蛋白誘導機體產生的IgG很有希望成為治療流感嗜血桿菌感染的抑菌或殺菌制劑的成份。有研究利用小鼠 NTHi急性肺部感染模型, 發現重組 Hap蛋白免疫抗 NHTi感染的免疫保護效果。

然而研究發現在流感嗜血桿菌生長過程中，Hap 表達量達到一定程度后，就會啟動自體解離，最終導致細菌的分散和在呼吸道內的傳播，因此普通的細菌培養不足以獲得足夠的Hap蛋白，要獲得大量Hap蛋白作為抗原制備抗體需進行生物學改造。

另外，分析Genbank公布的Hi菌株hap基因核苷酸序列發現，5’端156 bp和3’端855bp核苷酸及對應的氨基酸序列較為保守，中間區核苷酸和氨基酸序列長短不一且變異較大，因此用hap基因全長表達蛋白缺少良好的同源性。hap基因產物Hap均為膜表面蛋白抗原，蛋白抗原表位（epitope）是抗原分子中決定免疫原性短肽片段，將同源性高的抗原優勢表位融合并串聯后用基因工程方法進行表達，多抗原肽(multiple antigenic peptide，MAP)是抗原表位與高分子核心基質多聚天冬氨酸-賴氨酸(Poly-Asp-Lys)交聯而成的新型復合物，因其能提呈多種表位、提呈作用強、各表位肽之間形成構象表位而提高免疫效果、個別氨基酸突變不影響免疫應答等優點，已成為近年基因工程疫苗研制的新領域。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于涉及提供一種治療流感嗜血桿菌感染的血清的制備方法及該血清的應用的技術方案。

所述的一種治療流感嗜血桿菌感染的血清的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1）以流感嗜血桿菌基因組DNA為模板，采用連接引物 PCR 分別擴增帶柔性肽結構的hap-C4和hap-C150片段構建流感嗜血桿菌黏附Hap蛋白優勢表位融合基因hap-C4-GGGS-hap-C150；