[發(fā)明專利]一種治療流感嗜血桿菌感染的血清的制備方法及該血清的應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710757354.4
• 申請日: 2017-08-29
• 公開（公告）號: CN107586334B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發(fā)明（設計）人: 孫愛華;嚴杰;王榮山;金洪星;黃燕穎
• 申請（專利權）人: 杭州醫(yī)學院
• 主分類號: C07K16/06
• 分類號: C07K16/06;C07K16/12;C12N15/70;A61K39/40;A61P31/04
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 沈淵琪

1.一種治療流感嗜血桿菌感染的血清的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1）以不可分型流感嗜血桿菌標準菌株ATCC49247的DNA為模板，采用連接引物 PCR 分別擴增帶柔性肽結構的hap-C4和hap-C150片段構建流感嗜血桿菌黏附Hap蛋白優(yōu)勢表位融合基因hap-C4-GGGS-hap-C150；連接引物包括hap-C4-1和hap-C150-1，連接引物hap-C4-1包括hap-C4-1F和hap-C4-1R，所述的hap-C4-1F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的hap-C4-1R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，連接引物hap-C150-1包括hap-C150-1F和hap-C150-1R，所述的hap-C150-1F核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述的hap-C150-1R核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

2）以pUCm-T^{-hap-C4-GGGS-hap-C150}為模板，采用引物攜帶EK序列互補構建hap-C4-GGGS-hap-C150-EK串聯(lián)表位融合片段，hap-C4-2F和Hap-C150-2R為引物，引物hap-C4-2F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，引物Hap-C150-2R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；采用含核酸內切酶Nde I位點的hap-C4-3F以及含核酸內切酶XhoI位點的hap-C150-3R引物，所述的hap-C4-3F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述的hap-C150-3R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，以pUCm-T^{-8×[hap-C4-GGGS-hap-C150-EK]}為模板，擴增獲得NdeI-8×[Hap-C4-GGGS- Hap-C150-EK]-XhoI片段；

3）以NdeI-8×[Hap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]–XhoI構建原核表達系統(tǒng)EcoliBL21DE3^{pET42a-8×[Hap-C4-GGGS- Hap-C150-EK]}，原核表達系統(tǒng)Ecoli BL21DE3^{pET42a-8×[Hap-C4-GGGS- Hap-C150-EK]}誘導表達重組融合蛋白8×[rHap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]，重組融合蛋白8×[rHap-C4-GGGS-Hap-C150-EK]水解提純得到rHap-C4-GGGS-Hap-C150融合表位肽；

4）用碳二亞胺法將rHap-C4-GGGS-Hap-C150與Poly-Asp-Lys載體大分子交聯(lián)，制備出多抗原MAP交聯(lián)肽MAP- rHap-C4-GGGS-Hap-C150；

5）多抗原MAP交聯(lián)肽MAP- rHap-C4-GGGS-Hap-C150免疫小鼠，獲得治療流感嗜血桿菌感染的血清。

2.如權利要求1所述的一種治療流感嗜血桿菌感染的血清的制備方法，其特征在于所述的步驟1）具體為：

a以流感嗜血桿菌基因組DNA為模板，采用連接引物hap-C4-1和hap-C150-1 PCR 分別擴增帶柔性肽結構的hap-C4和hap-C150片段；連接引物hap-C4-1包括hap-C4-1F和hap-C4-1R，所述的hap-C4-1F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的hap-C4-1R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，連接引物hap-C150-1包括hap-C150-1F和hap-C150-1R，所述的hap-C150-1F核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述的hap-C150-1R核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

b回收步驟a得到的目的擴增產物，將回收的帶柔性肽結構的hap-C4和hap-C150擴增片段等摩爾混合，再進行PCR擴增；

c利用hap-C4下游和hap-C150上游引物中互補的柔性肽序列形成復合模板，加入引物hap-C4-1F和hap-C150-1R進行PCR擴增，得到hap-C4-GGGS-hap-C150。