[發明專利]抗H7N9亞型禽流感病毒單克隆抗體抗原表位及其篩選方法和應用

有效

• 申請號: 201710757257.5
• 申請日: 2017-08-29
• 公開（公告）號: CN107449912B
• 公開（公告）日: 2019-06-18
• 發明（設計）人: 彭大新;孫志豪;陳素娟;秦濤;劉秀梵
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C07K14/11
• 分類號: C07K14/11;G01N33/569
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 王加貴

本發明提供了抗H7N9亞型禽流感病毒單克隆抗體抗原表位及其篩選方法和應用，屬于免疫檢測技術領域。所述篩選方法是將野生型H7N9亞型禽流感病毒液與具有中和特性的相應單克隆抗體混合孵育，接種至SPF雞胚，得到血凝效價為陽性的尿囊液；將所述陽性尿囊液進行梯度稀釋，再次與單克隆抗體混合孵育接種至SPF雞胚中，選擇血凝效價為陽性的尿囊液為抗原測定單克隆抗體的血凝抑制效價，當所述尿囊液測定的血凝抑制效價比野生型病毒測定的血凝抑制效價低8log2時，判定為H7N9亞型禽流感病毒突變逃逸株，測定其HA基因序列，確定單克隆抗體所識別的抗原表位。所述方法明確篩選出針對特定抗原表位，方法簡單準確，篩選周期短。

技術領域

本發明屬于免疫檢測技術領域，具體涉及抗H7N9亞型禽流感病毒單克隆 抗體抗原表位及其篩選方法和應用。

背景技術

H7N9亞型禽流感病毒是甲型流感中的一種。要想有效預防H7N9亞型禽流 感就必須建立有效的檢測手段，以單克隆抗體為基礎的抗原捕獲ELISA、免疫 膠體金試紙條等是常用的方法。而建立這類檢測方法，需要多個針對不同抗 原表位的單克隆抗體，才能獲得敏感性和特異性均很高的檢測方法。

目前，確定抗原表位的方法主要為競爭抑制ELISA方法。競爭抑制ELISA 法的篩選機理如下：如果標記抗體與未標記抗體識別同一表位，其中一個單 克隆抗體的結合會影響另外一個單克隆抗體的結合，在反應體系中加入未標 記抗體將會抑制酶標記的抗體與包被抗原的結合。在這種情況下，加入未標 記單克隆抗體，讀值(OD450/630值)出現逐漸下降的趨勢；如果標記抗體與 未標記抗體識別不同表位，未標記抗體不能抑制酶標記抗體與包被抗原的結 合，加入未標記單克隆抗體，讀值(OD450/630值)會保持不變。且根據酶 標儀上讀取OD450/630數值計算阻斷率(阻斷率＝1-阻斷孔OD450/630值/對照 孔OD450/630值)。結果判斷為飽和孔阻斷率大于50％為阻斷陽性。但是當結 果判斷為單克隆抗體之間存在相互競爭時，有可能存在以下因素：(1)兩抗 體識別同一抗原表位；(2)兩抗體識別的表位接近，前一個抗體與抗原結合 后，阻礙了后一個抗體與抗原的結合；(3)兩個抗體識別的表位雖有一定的 距離，但其空間構象位置相近，當前一個抗體與抗原結合后形成了一定的空 間位阻影響后一個抗體的結合。所以采用競爭性抑制ELISA方法來分析單克 隆抗體識別的抗原表位時，陽性結果只能表明是以上幾種可能性，并不能將 單克隆抗體所針對的抗原表精確的定位到特定的抗原表位。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供針對不同抗原表位的抗H7N9亞型禽流 感病毒單克隆抗體的篩選方法和應用。本發明提供的篩選方法能夠精確定位 到特定的抗原表位，同時篩選得到的單克隆抗體所針對的抗原表位明確，有 利于監測特定抗原表位的H7N9亞型禽流感病毒。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了針對特定抗原表位的抗H7N9亞型禽流感病毒單克隆抗體 的篩選方法，包括以下步驟：

1)野生型H7N9亞型禽流感病毒液與具有中和特性的單克隆抗體腹水等 體積混合，20～28℃孵育1h，得到病毒抗體混合液，所述單克隆抗體由滅活的 野生型病毒株免疫動物通過雜交瘤技術得到；

2)將所述步驟1)得到的病毒抗體混合液接種至SPF雞胚，將接種后的 SPF雞胚在35℃條件下培養72h，得到尿囊液；

3)測定所述步驟2)得到尿囊液的血凝效價；

4)將所述步驟3)中測定結果為陽性的尿囊液進行梯度稀釋，將稀釋后 的尿囊液分別與0.5ml單克隆抗體腹水等體積混合，20～28℃孵育1h，孵育后 的梯度稀釋病毒抗體混合液分別接種至SPF雞胚；