[發(fā)明專利]抗H7N9亞型禽流感病毒單克隆抗體抗原表位及其篩選方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710757257.5
• 申請日: 2017-08-29
• 公開（公告）號: CN107449912B
• 公開（公告）日: 2019-06-18
• 發(fā)明（設計）人: 彭大新;孫志豪;陳素娟;秦濤;劉秀梵
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C07K14/11
• 分類號: C07K14/11;G01N33/569
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 王加貴

1.抗H7N9亞型禽流感病毒單克隆抗體抗原表位的篩選方法，包括以下步驟：

1)將野生型H7N9亞型禽流感病毒液與具有中和特性的單克隆抗體腹水等體積混合，20～28℃孵育1h，得到病毒抗體混合液，所述單克隆抗體由滅活野生型病毒株免疫動物通過雜交瘤技術得到；

2)將所述步驟1)得到的病毒抗體混合液接種至SPF雞胚，將接種后的SPF雞胚在35℃條件下培養(yǎng)72h，得到尿囊液；

3)測定所述步驟2)得到尿囊液的血凝效價；

4)將所述步驟3)中測定結果為陽性的尿囊液進行梯度稀釋，將稀釋后的尿囊液分別與0.5ml單克隆抗體腹水等體積混合，20～28℃孵育1h，孵育后的梯度稀釋病毒抗體混合液分別接種至SPF雞胚；

5)測定所述步驟4)中接種72h得到尿囊液的血凝效價，選擇最大稀釋度病毒抗體混合液接種雞胚所獲得的陽性尿囊液為抗原，測定單克隆抗體的血凝抑制效價，當所述尿囊液測定的血凝抑制效價比野生型病毒測定的血凝抑制效價低8log2時，判定陽性尿囊液為單克隆抗體的逃逸株；

6)將所述步驟5)得到的單克隆抗體的逃逸株接種至SPF雞胚培養(yǎng)，獲得雞胚尿囊液；

7)以所述步驟6)得到的尿囊液為樣品，利用RT-PCR法擴增HA基因，對得到的PCR產物進行測序，將所述測序得到的HA基因序列翻譯成氨基酸序列與野生型H7N9亞型禽流感病毒的HA基因氨基酸序列進行比對，氨基酸差異位點即為單克隆抗體所針對的抗原表位，鑒定出抗H7N9亞型禽流感病毒單克隆抗體的特定抗原表位；

擴增HA基因用引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如序列表中Seq IDNo.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中Seq ID No.2所示的核苷酸序列；

所述步驟2)、步驟4)或步驟6)中接種的接種量為每個SPF雞胚接種0.1ml；

所述步驟1)中H7N9亞型禽流感病毒液的病毒濃度為10⁶EID₅₀/0.5ml；

所述步驟4)中梯度稀釋包含四個梯度，分別為稀釋后的濃度為10^-5、10^-6、10^-7和10^-8。

2.根據(jù)權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述RT-PCR法的反應程序為預變性95℃3min；變性95℃15s，退火58℃15s，延伸72℃1min40s，共35個循環(huán)；延伸72℃5min。

3.根據(jù)權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟1)H7N9亞型禽流感病毒液與單克隆抗體腹水混合前預先稀釋；所述稀釋用溶液為PBS溶液；

所述PBS溶液的濃度為0.01mol/L；

所述PBS溶液的pH值為7.4。

4.根據(jù)權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟2)、步驟4)和步驟6)中SPF雞胚為10日齡雞胚。

5.權利要求1～4任意一項所述方法篩選得到的H7N9亞型禽流感病毒的特定抗原表位，所述抗原表位由HA基因編碼的蛋白質第136位氨基酸突變?yōu)镚和第227位氨基酸突變?yōu)镋組成；

所述HA基因是以H7N9亞型禽流感病毒A/CHICKEN/JIANGSU/W1-8/2015為基本病毒株，用正向引物和反向引物擴增得到；所述正向引物具有如序列表中Seq ID No.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中Seq ID No.2所示的核苷酸序列。

6.針對權利要求1～4任意一項所述方法篩選得到的抗原表位的或者權利要求5所述抗原表位的單克隆抗體在免疫檢測試劑中的應用。