[發明專利]一種觀察月季黑斑病侵染過程的石蠟切片染色方法

有效

• 申請號: 201710756558.6
• 申請日: 2017-08-29
• 公開（公告）號: CN107576552B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 潘會堂;徐庭亮;張啟翔;程堂仁;王佳
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N1/28
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發明涉及一種觀察月季黑斑病侵染過程的石蠟切片染色方法，在切片脫蠟至水后，先用1％結晶紫水溶液進行染色，再利用碘液進行媒染，最后用95％酒精進行脫色。選擇上述兩種染液和脫色方法，可將組織細胞染為藍色，將菌絲染色為紅色，為觀察黑斑病病程發展過程的觀察的提供了方法。而且本發明的方法通過改進的染色方法，大大縮短了利用石蠟切片觀察月季黑斑病侵染葉片進程的染色時間，提高了試驗效率。

技術領域

本發明涉及植物顯微技術領域，具體是一種觀察植物葉部真菌病害組織病理學過程的染色方法

背景技術

植物葉部真菌病害往往造成植物葉部病斑、黃化、早期落葉，嚴重者直接導致植物死亡，影響了植物正常生長發育，增加了栽培管理養護成本。

月季是四大切花之首，是薔薇科薔薇屬多年生木本花卉，具有花期長、花色豐富、株型各異等優點。而月季黑斑病是一種庭院栽培中發生率極高且破壞性極強的真菌病害，常造成葉片表面著生黑斑、黃化、脫落等癥狀。該病害一般爆發于高溫多雨季節，嚴重影響了觀賞效果。該病害由薔薇盤二孢(Marssonina rosae)引起，該真菌能夠侵入寄主的葉片造成病害，該病原真菌在生活史后期能產生大量的分生孢子，擴張非常快。在月季的抗病研究中，為測驗品種的抗病性等，經常將月季黑斑病作為研究對象。此外，在園林植物病原菌和寄主互作的領域，月季黑斑病的研究價值很高。盡管月季黑斑病在月季的病害研究中占有重要的地位，但有關該病害的組織病理學還不清楚，制約了月季黑斑病研究的開展。本發明為包括月季黑斑病在內的植物葉部病害組織病理學的研究直接提供了可靠方法，為解決病理學研究的關鍵內容提供了技術支持。

對于葉部真菌病害的組織病理學入侵過程的研究，傳統的研究方法有很多，包括透明膠帶粘貼、漂白觀察和組織整體透明等方法。但這些方法在月季葉片真菌病害研究中有一定的局限性，在月季黑斑病研究過程中，通過傳統方法只能獲得一些寄主表面的病原菌結構，不能清晰地展現植物組織內部的真菌，并對其進行染色。本發明能夠很好地彌補這些不足，在技術層面上解決科研難題。

發明內容

本發明的目的是解決常規切片技術制備的侵染葉片中植物細胞壁著藍色、植物細胞核以及病原菌共同著紅色，導致無法明確區分真菌與植物細胞核的問題，提供一種觀察植物葉部真菌病害組織病理學過程的染色方法。本發明的染色過程快捷方便、質量好，能夠為相關科學研究提供技術支持。

本發明的方法為，在切片脫蠟至水后，先用1％結晶紫水溶液進行染色，再利用碘液進行媒染，最后用95％酒精進行脫色。

優選的，本發明的方法包括如下步驟：

1)切片脫蠟至水后，將切片置于1％的結晶紫水溶液中染色5～10min；

2)用蒸餾水沖去染色后的切片表面的結晶紫；

3)用碘液處理沖洗后的切片30～60s，進行媒染；

4)用95％酒精清洗媒染后的切片15～60s，進行脫色；

5)用無水乙醇脫水5～10s。

上述操作中，用蒸餾水沖去染色后切片表面的結晶紫，可避免結晶紫持續染色，實現適度染色，用95％的酒精清洗媒染后的切片，可脫去與植物組織結合的染液，實現真菌菌絲著紅色，植物組織為藍色的效果。

優選的，所述步驟2)中的具體操作為用蒸餾水快速沖洗載玻片兩次，每次5s。

優選的，所述步驟3)中的媒染時間為30s。

在操作的過程中，本發明的方案在選擇上述的兩種優選條件后，可優化真菌菌絲著紅色，植物組織為藍色的染色效果。

優選的，所述步驟1)中將切片脫蠟至水后，將切片置于1％的結晶紫水溶液中染色5min；

優選的，所述步驟4)中用95％酒精快速清洗媒染后的切片60s，清洗2次。