[發明專利]一種將miRNA從石墨烯上解吸附的方法

有效

• 申請號: 201710756474.2
• 申請日: 2017-08-29
• 公開（公告）號: CN107447011B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 閆赫;邢婉麗
• 申請（專利權）人: 博奧生物集團有限公司;清華大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 劉猛;趙青朵

本發明涉及分析化學和生物檢測技術領域，公開了一種將miRNA從石墨烯上解吸附的方法。本發明所述方法將吸附有miRNA的石墨烯直接進行原位反轉錄，將miRNA解吸附下來。本發明本采用原位反轉錄的方式，即直接對吸附有miRNA的石墨烯材料進行逆轉錄，其解吸效率顯著高于現有技術中方案，且產物對后續反應沒有抑制效果，可直接用于后續的PCR。

技術領域

本發明涉及分析化學和生物檢測技術領域，具體涉及一種將miRNA從石墨烯上解吸附的方法。

背景技術

MicroRNA(miRNA)是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，主要參與轉錄后基因表達的調控，其能夠和目的mRNA的結合使目的基因沉默或者降低表達，從而起到調控機體的作用。miRNA的檢測是眾多核酸檢測領域中重要的一個環節，因為其含量的變化往往和癌癥的發生有著密切的關系。

目前，根據相關文獻報道，氧化石墨烯(GO)或還原氧化石墨烯(rGO)由于富含π電子云，能夠過π-π相互作用使短單鏈核酸吸附在石墨烯表面，并且rGO或GO能夠猝滅靠近其的熒光基團。

有研究報道提出(Xiaoli Zhu et al.,Chem.Commun.,2015,51,10002-10005.)利用滾還擴增(RCA)完成了對吸附在石墨烯表面的miRNA的檢測。但是為了使得miRNA的檢測更加具有普適性，即使用PCR來檢測miRNA，其吸附在石墨烯表面后的解吸附是十分必要的。根據文獻報道，cDNA，隨機DNA，BSA，堿，尿素或者異丙醇的加入，以及在加熱條件下可以使吸附在石墨烯表面的單鏈核酸適當解吸附(Chang Lu et al.,Langmuir,2016,32,10776-10783)，但是這些方法存在解吸效率低，不兼容后續PCR等缺點，例如，BSA和cDNA對吸附在石墨烯表面的單鏈核酸的解吸效率只有25％左右，堿，尿素和異丙醇的加入會抑制后續的反轉錄和PCR。可見尋找一種高效和具備下游兼容性的解吸方法對miRNA的檢測至關重要。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種將miRNA從石墨烯上解吸附的方法，使得所述方法具備較高的解吸附效率，且產物對后續反應沒有抑制效果，可直接用于后續的PCR。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種將miRNA從石墨烯上解吸附的方法，將吸附有miRNA的石墨烯直接進行原位反轉錄，將miRNA解吸附下來。

針對現有對吸附在石墨烯表面的單鏈核酸解吸附的方法效率不高以及影響后續反轉錄和PCR的缺陷，本發明直接進行原位反轉錄進行解吸附，將解吸附和反轉錄合為一步，不僅提高了miRNA的解吸附效率，并且不影響后續PCR擴增的環節。

作為優選，本發明所述原位反轉錄的體系為：

8-16μL原位反轉錄buffer、1-5μL反轉錄酶、余量水，共20μL。

在本發明具體實施方式中，所述原位反轉錄buffer可以是8μL、10μL、12μL或16μL，所述反轉錄酶可以是1μL、2μL、3μL、4μL或5μL。更為具體的，所述原位反轉錄的體系為：10μL原位反轉錄buffer、2μL反轉錄酶、8μL水，共20μL。所述原位反轉錄體系可通過市售途徑獲得，例如天根生化科技(北京)有限公司，名稱為miRcute Plus miRNA Fisrt-Strand cDNASynthesis Kit.。其中，所述反轉錄酶為兩種酶組分，一種為E.coli Poly(A)polymerase,另一種為RTase，首先miRNA在E.coli Poly(A)polymerase的作用下進行3’端加多聚A尾，再在Oligo(dT)通用逆轉錄引物和RTase的作用下進行逆轉錄反應。

作為優選，所述原位反轉錄在42℃下進行1小時。