[發明專利]一種人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法

在審

• 申請號: 201710756221.5
• 申請日: 2017-08-29
• 公開（公告）號: CN107779464A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發明（設計）人: 朱斌輝;朱艷娟;許仁杰;韓蓉
• 申請（專利權）人: 蘇州東泉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/62;C12N9/02
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司32200
• 代理人: 孫昱

1. 一種用于構建人源銅鋅超氧化物歧化酶重組載體的核苷酸序列，其特征在于，該序列包括在人源銅鋅超氧化物歧化酶N末端添加His-TEV標簽，該序列如SEQ ID NO.2所示。

2. 一種人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，將SEQ ID NO.2所示的序列通過人工合成的方式插入原始載體，構建重組載體，擴大培養后提取表達產物，N-His-TEV-hSOD1酶解，純化得到無標簽的hSOD1。

3.根據權利要求2所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，所述原始載體為真核表達載體或原核表達載體。

4.根據權利要求3所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，所述原始載體為pET28a。

5.根據權利要求2所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，N-His-TEV-hSOD1酶解采用TEV蛋白酶。

6.根據權利要求2所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將SEQ ID NO.2的序列以人工合成的方式插入原始載體中，以構建重組載體；

（2）將重組載體導入表達菌株，得到重組菌株；

（3）將重組菌株擴大培養；

（4）將菌體破碎，離心得到上清液；

（5）將上清液純化，得到純化后帶標簽的N-His-TEV-hSOD1；

（6）將N-His-TEV-hSOD1酶解，得到切除標簽的酶液；

（7）將切除標簽的酶液純化，得到純化后的無標簽的hSOD1。

7.根據權利要求6所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，步驟（2）中表達菌株為大腸桿菌，優選大腸桿菌Codonplus。

8.根據權利要求6所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，步驟（3）中重組菌株擴大培養中還加入了銅離子和鋅離子。

9. 根據權利要求6所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，步驟（3）中重組菌株擴大培養過程為將重組菌株 在25~37℃、含10~50μg/mL卡那霉素和10~50μg/mL氯霉素的LB培養基中培養至 OD₆₀₀達0.4~1.0，加入終濃度為 0.1-1.0mM 的 IPTG，在 15~42℃下誘導 4~16 小時，離心收集菌體。

10. 根據權利要求9所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，培養至OD₆₀₀達0.4~1.0，加入終濃度為 0.1-1.0mM 的 IPTG，同時分別加入500μM以內的 Cu²⁺和Zn²⁺，誘導溫度為15~42℃，誘導時間為4~16小時。