[發(fā)明專利]一種人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710756221.5
• 申請(qǐng)日: 2017-08-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107779464A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱斌輝;朱艷娟;許仁杰;韓蓉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州東泉生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/62;C12N9/02
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司32200
• 代理人: 孫昱

1. 一種用于構(gòu)建人源銅鋅超氧化物歧化酶重組載體的核苷酸序列，其特征在于，該序列包括在人源銅鋅超氧化物歧化酶N末端添加His-TEV標(biāo)簽，該序列如SEQ ID NO.2所示。

2. 一種人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，將SEQ ID NO.2所示的序列通過(guò)人工合成的方式插入原始載體，構(gòu)建重組載體，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取表達(dá)產(chǎn)物，N-His-TEV-hSOD1酶解，純化得到無(wú)標(biāo)簽的hSOD1。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，所述原始載體為真核表達(dá)載體或原核表達(dá)載體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，所述原始載體為pET28a。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，N-His-TEV-hSOD1酶解采用TEV蛋白酶。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將SEQ ID NO.2的序列以人工合成的方式插入原始載體中，以構(gòu)建重組載體；

（2）將重組載體導(dǎo)入表達(dá)菌株，得到重組菌株；

（3）將重組菌株擴(kuò)大培養(yǎng)；

（4）將菌體破碎，離心得到上清液；

（5）將上清液純化，得到純化后帶標(biāo)簽的N-His-TEV-hSOD1；

（6）將N-His-TEV-hSOD1酶解，得到切除標(biāo)簽的酶液；

（7）將切除標(biāo)簽的酶液純化，得到純化后的無(wú)標(biāo)簽的hSOD1。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，步驟（2）中表達(dá)菌株為大腸桿菌，優(yōu)選大腸桿菌Codonplus。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，步驟（3）中重組菌株擴(kuò)大培養(yǎng)中還加入了銅離子和鋅離子。

9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，步驟（3）中重組菌株擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程為將重組菌株 在25~37℃、含10~50μg/mL卡那霉素和10~50μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至 OD₆₀₀達(dá)0.4~1.0，加入終濃度為 0.1-1.0mM 的 IPTG，在 15~42℃下誘導(dǎo) 4~16 小時(shí)，離心收集菌體。

10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)0.4~1.0，加入終濃度為 0.1-1.0mM 的 IPTG，同時(shí)分別加入500μM以內(nèi)的 Cu²⁺和Zn²⁺，誘導(dǎo)溫度為15~42℃，誘導(dǎo)時(shí)間為4~16小時(shí)。