[發(fā)明專(zhuān)利]一種人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710756221.5
• 申請(qǐng)日: 2017-08-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107779464A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱斌輝;朱艷娟;許仁杰;韓蓉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 蘇州東泉生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/70
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/70;C12N15/62;C12N9/02
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司32200
• 代理人: 孫昱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于超氧化物歧化酶制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人源銅鋅超氧化物歧化酶的制 備方法。

背景技術(shù)

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡(jiǎn)稱(chēng)SOD)，是一類(lèi)廣泛存在于生物體內(nèi)的金 屬酶，能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，平衡機(jī)體內(nèi)的氧自由基。SOD在防輻射、 抗衰老、消炎、抑制腫瘤和癌癥、自身免疫治療等方面顯示出獨(dú)特的功能，在醫(yī)學(xué)、食品、 化妝品等領(lǐng)域得到越來(lái)越多的應(yīng)用。

到目前為止，已從細(xì)菌、原生動(dòng)物、藻類(lèi)、霉菌、植物、昆蟲(chóng)、鳥(niǎo)、魚(yú)類(lèi)和哺乳動(dòng)物 等生物體內(nèi)分離得到SOD。根據(jù)其活性中心結(jié)合的金屬離子的不同，SOD主要分為三類(lèi)： 銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和錳超氧化物歧化酶 (Mn-SOD)。其中，F(xiàn)e-SOD主要存在于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的基質(zhì)中，Mn-SOD主要存在 于原核細(xì)胞和少數(shù)植物細(xì)胞中，而Cu/Zn-SOD則主要存在于包括人類(lèi)在內(nèi)的真核生物細(xì)胞 的細(xì)胞質(zhì)中。因此，最適合人體使用的SOD為Cu/Zn-SOD。

國(guó)內(nèi)Cu/Zn-SOD的研究主要側(cè)重于動(dòng)植物的提取和純化。其中動(dòng)物來(lái)源的，由于存在 原材料有限及衛(wèi)生安全性等問(wèn)題，導(dǎo)致制品產(chǎn)量有限，且血液制品的安全性風(fēng)險(xiǎn)大；而植 物來(lái)源的與人自身的有一定差異，存在免疫原性等問(wèn)題。因此，利用基因工程生產(chǎn)人源銅 鋅超氧化物歧化酶是解決原料來(lái)源、獲得無(wú)免疫原性、高活性Cu/Zn-SOD的有效途徑。目 前已有通過(guò)基因工程技術(shù)生產(chǎn)人源銅鋅超氧化物歧化酶(hSOD1)的先例，但仍存在許多 問(wèn)題，主要包括：(1)目的蛋白表達(dá)量不高，由于異源表達(dá)系統(tǒng)影響目的蛋白表達(dá)量；(2) 純化過(guò)程復(fù)雜，不帶純化標(biāo)簽的需要經(jīng)過(guò)離子交換、分子排阻和/或等一系列的層析手段進(jìn) 行純化，而帶純化標(biāo)簽的以包涵體形式存在，又需要經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性等繁瑣的工藝獲得活 性形式。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種人源銅鋅超氧化物歧化酶的 制備方法，提高目的蛋白的表達(dá)量，提高酶的比活力，簡(jiǎn)化制備過(guò)程。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種用于構(gòu)建人源銅鋅超氧化物歧化酶重組載體的核苷酸序列，該序列包括在人源銅 鋅超氧化物歧化酶N末端添加的His-TEV標(biāo)簽，該序列如SEQ ID NO.2所示。

一種人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，將SEQ ID NO.2所示的序列插入原始載體， 構(gòu)建重組載體，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取表達(dá)產(chǎn)物，N-His-TEV-hSOD1酶解，純化得到無(wú)標(biāo)簽的 hSOD1。

進(jìn)一步地，所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，所述原始載體可以為真核表 達(dá)載體或原核表達(dá)載體。

進(jìn)一步地，所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，所述原始載體可以為pET28a。

進(jìn)一步地，所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，N-His-TEV-hSOD1酶解采用 TEV蛋白酶。

進(jìn)一步地，所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)將SEQ ID NO.2的序列以人工合成的方式插入原始載體中，以構(gòu)建重組載體；

(2)將重組載體導(dǎo)入表達(dá)菌株，得到重組菌株；

(3)將重組菌株擴(kuò)大培養(yǎng)；

(4)將菌體破碎，離心得到上清液；

(5)將上清液純化，得到純化后帶標(biāo)簽的N-His-TEV-hSOD1；

(6)將N-His-TEV-hSOD1酶解，得到切除標(biāo)簽的酶液；

(7)將切除標(biāo)簽的酶液純化，得到純化后的無(wú)標(biāo)簽的hSOD1。

進(jìn)一步地，所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，步驟(2)中表達(dá)菌株為大腸 桿菌，優(yōu)選大腸桿菌Codonplus。

進(jìn)一步地，所述的人源銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，步驟(3)中重組菌株擴(kuò)大培 養(yǎng)過(guò)程為將重組菌株在25～37℃、含10～50μg/mL卡那霉素和10～50μg/mL氯霉素的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)0.4～1.0，加入終濃度為0.1-1.0mM的IPTG，在15～42℃下誘導(dǎo) 4～16小時(shí)，離心收集菌體；更進(jìn)一步地，培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)0.4～1.0，加入終濃度為0.1-1.0mM 的IPTG，同時(shí)分別加入500μM以?xún)?nèi)的Cu²⁺和Zn²⁺，誘導(dǎo)溫度為15～42℃，誘導(dǎo)時(shí)間為4～16 小時(shí)。