[發明專利]一種cik免疫細胞的體外誘導擴增方法

在審

• 申請號: 201710739714.8
• 申請日: 2017-08-25
• 公開（公告）號: CN107418933A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 朱學義;徐峰波;陳樂;王豪東;陳艷普;王秋文
• 申請（專利權）人: 河南省銀豐生物工程技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 南京源古知識產權代理事務所(普通合伙)32300
• 代理人: 馬曉輝

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種cik免疫細胞的體外誘導擴增方法。

背景技術

CIK免疫細胞，即細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokine-InducedKiller，CIK)，細胞毒作用強，具有一定的免疫特性。由于該細胞同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又稱為NK細胞(自然殺傷細胞)樣T淋巴細胞，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性，和NK細胞的非MHC限制性殺瘤優點。該細胞對腫瘤細胞的識別能力很強，如同“細胞導彈”，能精確“點射”腫瘤細胞，但不會傷及“無辜”的正常細胞。尤其對手術后或放化療后患者效果顯著，能消除殘留微小的轉移病灶，防止癌細胞擴散和復發，提高機體免疫力，因此，CIK細胞被認為是新一代的腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方案。CIK免疫細胞擴增能力限制了其在臨床上進一步的推廣應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種cik免疫細胞的體外誘導擴增方法，以提高cik免疫細胞的擴增速度。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

一種cik免疫細胞的體外誘導擴增方法，包括以下步驟：

(1)將純化的CD3單克隆抗體溶液室溫下包被細胞培養板，并于4℃存儲備用；

(2)將分離得到的單個核細胞以基礎培養基培養，接種于細胞培養板中，通過γ-干擾素溶液刺激細胞24h，之后經離心、換液，轉移至步驟(1)得到的CD3單克隆抗體包被的細胞培養板中培養，每隔2-3d換培養液，并每隔5-10天懸浮刺激細胞，培養至20-25d時，結束培養。

所述步驟(1)中，包被的細胞培養板在使用之前，需吸出孔內的CD3單克隆抗體溶液，并用D-Hanks緩沖液沖洗細胞培養板。

所述步驟(2)中，基礎培養基為PRMI-1640培養基。

所述步驟(2)中，培養液中含有白細胞介素-1、白細胞介素-2。

所述步驟(2)中，白細胞介素-1、白細胞介素-2的濃度分別為50-200U/mL，100-200U/mL。

所述步驟(2)中，保持細胞密度為0.8-1.2*10⁶個/mL。

所述步驟(2)中，γ-干擾素溶液的濃度為500-1000U/mL。

有益效果：本發明的cik免疫細胞的體外誘導擴增方法，減少了cik免疫細胞的培養時間及培養成本，能夠提高cik免疫細胞的擴增速度。

具體實施方式

根據下述實施例，可以更好的理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。

實施例1

一種cik免疫細胞的體外誘導擴增方法，包括以下步驟：

(1)將純化的CD3單克隆抗體溶液室溫下包被細胞培養板，并于4℃存儲備用；包被的細胞培養板在使用之前，需吸出孔內的CD3單克隆抗體溶液，并用D-Hanks緩沖液沖洗細胞培養板；

(2)將分離得到的單個核細胞以基礎培養基PRMI-1640培養，接種于細胞培養板中，通過濃度為1000U/mL的γ-干擾素溶液刺激細胞24h，之后經離心、換液，轉移至步驟(1)得到的CD3單克隆抗體包被的細胞培養板中培養，每隔2d換培養液，培養液中白細胞介素-1、白細胞介素-2的濃度分別為50U/mL，200U/mL。并每隔5天懸浮刺激細胞，培養至20d時，培養過程中保持細胞密度為1.2*10⁶個/mL，結束培養。

實施例2

一種cik免疫細胞的體外誘導擴增方法，包括以下步驟：

(1)將純化的CD3單克隆抗體溶液室溫下包被細胞培養板，并于4℃存儲備用；包被的細胞培養板在使用之前，需吸出孔內的CD3單克隆抗體溶液，并用D-Hanks緩沖液沖洗細胞培養板；

(2)將分離得到的單個核細胞以基礎培養基PRMI-1640培養，接種于細胞培養板中，通過濃度為500U/mL的γ-干擾素溶液刺激細胞24h，之后經離心、換液，轉移至步驟(1)得到的CD3單克隆抗體包被的細胞培養板中培養，每隔3d換培養液，培養液中白細胞介素-1、白細胞介素-2的濃度分別為100U/mL，150U/mL。并每隔10天懸浮刺激細胞，培養至25d時，培養過程中保持細胞密度為0.8*10⁶個/mL，結束培養。

實施例3

一種cik免疫細胞的體外誘導擴增方法，包括以下步驟：