[發明專利]一種多環芳烴污染土壤中外源降解菌的施加方法

在審

• 申請號: 201710734934.1
• 申請日: 2017-08-24
• 公開（公告）號: CN107299150A
• 公開（公告）日: 2017-10-27
• 發明（設計）人: 張聞;王加寧;高永超;黃玉杰;季蕾;郭書海;陳貫虹;鄭立穩;王磊磊
• 申請（專利權）人: 山東省科學院生態研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;B09C1/10;C12R1/38
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司37219
• 代理人: 朱家富

技術領域

本發明涉及一種多環芳烴污染土壤中外源降解菌的施加方法，特別涉及一種針對多環芳烴污染土壤及環境中外源降解菌定量、特異檢測及施加的方法，屬于土壤微生物檢測技術領域。

背景技術

有機污染土壤的生物修復法因具有成本低、無二次污染、可大面積應用等優點受到廣泛關注。生物強化法是生物修復的重要手段之一，其主體是人為投加有高效降解能力的降解菌或菌群。外源降解菌進入污染環境后，會受污染物脅迫，并與土著菌競爭，其存活和增殖情況在整個修復期內呈現動態變化。通過對降解菌進行實時定量的追蹤，可準確了解其進入環境后的存活和增殖情況，從而改進修復時菌劑的投加量和投加方式，提高修復效果。因此有必要開發出針對特定外源降解菌在環境中的數量檢測方法。

傳統的微生物數量檢測方法有稀釋平板法、血球計數板法等，但這些方法只能對樣品中的全部微生物進行無差別的計數，無法對樣品中的微生物進行準確的種屬區分，因此無法排除環境樣品中土著微生物的干擾對特定菌株進行數量檢測。

實時熒光定量PCR技術具有靈敏性高、精確性好、特異性強和安全快速等優點，已被應用于檢測環境樣品中的目標微生物。但目前基于實時熒光定量PCR技術對有機污染土壤及其他環境樣品中微生物的定量方法多以16S/18S rDNA或功能基因為目的基因，研究多集中于某類或某幾類土著降解菌，缺少對某種特定外源降解菌進入環境后的數量分布情況的關注。其主要技術難點在于針對能夠高效處理有機污染物的外源微生物菌株，需要找到該微生物菌株與土著降解菌及土著同種屬菌具有差異的特異性基因序列及特異性引物。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種多環芳烴污染土壤中外源降解菌的施加方法。

本發明的技術方案如下：

一種多環芳烴污染土壤中外源降解菌的施加方法，步驟如下：

(1)采集土壤樣品，測定含水率，-20℃以下保存；

(2)提取樣品中的基因組DNA，制得DNA模板；

(3)對步驟(2)制得的DNA模板進行實時熒光定量PCR擴增，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，然后根據標準曲線，計算目標菌數量；所述標準曲線如下：

Y＝-3.365X+37.624；

其中：R²＝0.9999，Y為實時熒光定量PCR反應的Ct值，X為菌的標準質粒拷貝數對數值；

(4)調整土壤含水率至20-50％，疏松土壤，根據土壤多環芳烴污染物含量及土壤營養元素含量，添加氮磷肥料，調節污染土壤的碳、氮、磷的摩爾比為(100～120)：(5～10)：1，投加外源假單胞菌(Psedomonassp.)PPZ-1的數量至10⁹CFU/g土，隔周翻攪一次，維持土壤含水率20～50％，每周檢測外源降解菌的數量及多環芳烴殘留量，當外源降解菌數量低于10⁷CFU/g土時，補加外源假單胞菌(Psedomonassp.)PPZ-1的數量至10⁹CFU/g土，直至多環芳烴殘留量達到處理要求。

所述外源假單胞菌(Psedomonassp.)PPZ-1分離自多環芳烴污染土壤，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號CGMCC No.12596。

根據本發明優選的，所述步驟(3)中，熒光定量PCR擴增的反應體系如下，總體系20μl：

2×SybrGreenqPCR Master Mix10μl；濃度10μM的上游引物0.4μl；濃度10μM的下游引物0.4μl；ddH₂0 7.2μl；DNA模板2μl；

所述熒光定量PCR擴增的反應條件如下：

95℃預變性3min；95℃變性15s，57℃退火20s，72℃延伸30s，45個循環。

根據本發明優選的，所述步驟(4)中，多環芳烴為菲。

有益效果

本發明首次通過利用實時熒光定量PCR的方法特異性監測土壤中外源多環芳烴降解菌假單胞菌(Psedomonas sp.)PPZ-1，并通過控制土壤中的外源多環芳烴降解菌的菌量實現快速降解土壤中多環芳烴的目的。

附圖說明

圖1、瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖中：1、2、3、4分別對應實施例1中引物組1、引物組2、引物組3和引物組4，土1為濟南土，土2為浙江土；

圖2、實時熒光定量PCR擴增曲線圖；

圖3、實時熒光定量PCR熔解曲線圖；