[發明專利]一種多環芳烴污染土壤中外源降解菌的施加方法

在審

• 申請號: 201710734934.1
• 申請日: 2017-08-24
• 公開（公告）號: CN107299150A
• 公開（公告）日: 2017-10-27
• 發明（設計）人: 張聞;王加寧;高永超;黃玉杰;季蕾;郭書海;陳貫虹;鄭立穩;王磊磊
• 申請（專利權）人: 山東省科學院生態研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;B09C1/10;C12R1/38
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司37219
• 代理人: 朱家富

1.一種多環芳烴污染土壤中外源降解菌的施加方法，其特征在于，步驟如下：

(1)采集土壤樣品，測定含水率，-20℃以下保存；

(2)提取樣品中的基因組DNA，制得DNA模板；

(3)對步驟(2)制得的DNA模板進行實時熒光定量PCR擴增，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，然后根據標準曲線，計算目標菌數量；所述標準曲線如下：

Y＝-3.365X+37.624；

其中：R²＝0.9999，Y為實時熒光定量PCR反應的Ct值，X為菌的標準質粒拷貝數對數值；

(4)調整土壤含水率至20-50％，疏松土壤，根據土壤多環芳烴污染物含量及土壤營養元素含量，添加氮磷肥料，調節污染土壤的碳、氮、磷的摩爾比為(100～120)：(5～10)：1，投加外源假單胞菌(Psedomonassp.)PPZ-1的數量至10⁹CFU/g土，隔周翻攪一次，維持土壤含水率20～50％，每周檢測外源降解菌的數量及多環芳烴殘留量，當外源降解菌數量低于10⁷CFU/g土時，補加外源假單胞菌(Psedomonassp.)PPZ-1的數量至10⁹CFU/g土，直至多環芳烴殘留量達到處理要求。

2.如權利要求1所述的施加方法，其特征在于，所述外源假單胞菌(Psedomonassp.)PPZ-1保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號CGMCC No.12596。

3.如權利要求1所述的施加方法，其特征在于，所述步驟(3)中，熒光定量PCR擴增的反應體系如下，總體系20μl：

2×SybrGreenqPCR Master Mix10μl；濃度10μM的上游引物0.4μl；濃度10μM的下游引物0.4μl；ddH₂0 7.2μl；DNA模板2μl。

4.如權利要求1所述的施加方法，其特征在于，所述步驟(3)中，熒光定量PCR擴增的反應條件如下：

95℃預變性3min；95℃變性15s，57℃退火20s，72℃延伸30s，45個循環。

5.如權利要求1所述的施加方法，其特征在于，所述步驟(4)中，多環芳烴為菲。