[發(fā)明專利]運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)創(chuàng)制粉色果實番茄的基因編輯方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710734041.7
• 申請日: 2017-08-24
• 公開（公告）號: CN107312795A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 程遠(yuǎn);萬紅建;周國治;姚祝平;王榮青;阮美穎;李志邈;葉青靜;楊悅儉
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/113;A01H5/00;A01H4/00
• 代理公司: 杭州五洲普華專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)33260
• 代理人: 龔玉平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及番茄轉(zhuǎn)基因材料的構(gòu)建，特別涉及運用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)將紅果番茄材料轉(zhuǎn)變?yōu)榉酃巡牧系幕蚓庉嫹椒ā?/p>

背景技術(shù)

番茄是世界上最重要的蔬菜作物之一，也是果實類研究模式植物。目前在番茄生產(chǎn)上，歐美地區(qū)消費習(xí)慣以大紅色果實番茄為主，而部分亞洲國家，尤其是中國和日本，則有一定的粉色果實番茄消費習(xí)慣。由于紅果番茄育種工作開展早、積累材料豐富，紅果番茄材料的豐產(chǎn)性、抗病性和商品性等相關(guān)特征總體上優(yōu)于粉果番茄。因此，在育種工作中可利用的紅果優(yōu)異種質(zhì)資源也遠(yuǎn)多于粉果材料。番茄果實顏色取決于果皮和果肉顏色，當(dāng)果肉顏色為粉紅色時，黃色果皮的番茄果實呈現(xiàn)紅色，而透明果皮的番茄呈現(xiàn)粉紅色。SlMYB12是番茄MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，相關(guān)文獻(xiàn)證明SlMYB12基因編碼蛋白通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控番茄果皮中類黃酮含量決定果皮顏色，當(dāng)SlMYB12突變時，類黃酮合成路徑被阻斷，番茄果實果皮顏色呈透明。

在過去數(shù)年中，有相關(guān)研究通過QTL，病毒誘導(dǎo)基因沉默等生物學(xué)技術(shù)手段進行SlMYB12與透明果皮之間的相關(guān)性研究。但是以上技術(shù)手段不能完全抑制SlMYB12基因在番茄中的轉(zhuǎn)錄和翻譯，且獲得的材料不能穩(wěn)定遺傳。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是近幾年新發(fā)展起來的一種基因組定向編輯技術(shù)。至今為止，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已經(jīng)在多種植物中實現(xiàn)了定點突變誘導(dǎo)(插入、缺失或修飾等)。由于成本低廉、操作簡易和突變誘導(dǎo)率高等特點，CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一項高效植物遺傳改良和育種研究的分子操作技術(shù)手段，應(yīng)用前景十分廣闊。但是，目前尚無運用該技術(shù)敲除水稻SlMYB12基因，實現(xiàn)番茄果實顏色從紅色轉(zhuǎn)為粉色的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的問題是，克服現(xiàn)有傳統(tǒng)番茄育種技術(shù)周期長、效率低的不足和現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因技術(shù)無法定向敲除基因的問題，提供一種運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除紅果番茄材料SlMYB12基因的基因編輯方法，以獲得完全喪失SlMYB12功能，穩(wěn)定遺傳且無外源基因插入的理想粉果番茄突變體。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決：

一種運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除番茄SlMYB12基因編輯方法，包括以下步驟：

(1)gRNA靶位點的選擇，SlMYB12位于番茄基因組的1號染色體上，利用CRISPR-Plant在線設(shè)計工具，根據(jù)CRISPR/Cas9技術(shù)設(shè)計靶位點的原則，把靶位點設(shè)計在SlMYB12基因的5’端第一個外顯子上；

(2)gRNA的片段克隆，以番茄(Solanum lycopersicum)基因組DNA序列為參考，設(shè)計兩段oligo序列，其中F和R分別代表正、反向引物：

Target-F：5’-TTGTGGGCATCAAGAGAGGCAGA-3’

Target-R：5’-AACTCTGCCTCTCTTGATGCCCA-3’

反應(yīng)體系為：Target-F 5μL；Target-R 5μL；H₂O 15μL

反應(yīng)條件為：95℃，3min；95℃到25℃室溫條件下緩慢冷卻；16℃5min；

(3)靶標(biāo)序列插入Cas9/sgRNA載體：將上一步獲得的退火oligo產(chǎn)物通過同源重組插入Cas9/sgRNA載體。取oligo二聚體1μL，與1μL Cas9/gRNA，1μL Solution 1，1μL Solution 2，6μL H₂O混合均勻，在PCR儀中16℃反應(yīng)2小時完成重組連接；

(4)載體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化：將連接后的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素(Kanamycin)平板培養(yǎng)過夜，挑取單菌落搖菌培養(yǎng)，抽取質(zhì)粒樣品測序，測序結(jié)果正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101；

(5)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番茄愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因植株：以野生型番茄Alisa Craig為材料誘導(dǎo)愈傷組織，進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄轉(zhuǎn)化實驗，經(jīng)潮霉素抗性篩選，抗性愈傷組織分化再生獲得轉(zhuǎn)基因陽性株系；