[發明專利]運用CRISPR/Cas9系統創制粉色果實番茄的基因編輯方法

在審

• 申請號: 201710734041.7
• 申請日: 2017-08-24
• 公開（公告）號: CN107312795A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發明（設計）人: 程遠;萬紅建;周國治;姚祝平;王榮青;阮美穎;李志邈;葉青靜;楊悅儉
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/113;A01H5/00;A01H4/00
• 代理公司: 杭州五洲普華專利代理事務所(特殊普通合伙)33260
• 代理人: 龔玉平

1.運用CRISPR/Cas9系統敲除番茄SlMYB12的基因編輯方法，其特征在于，

包括gRNA靶位點設計在SlMYB12基因的上游5’端第一個外顯子上的序列，為：F:5’-TGGGCATCAAGAGAGGCAGA-3’，R:5’-TCTGCCTCTCTTGATGCCCA-3’；

包括gRNA靶位點對應oligo二聚體的合成的序列，oligo序列為：Target-F：5’-TTGTGGGCATCAAGAGAGGCAGA-3’Target-R：5’-AACTCTGCCTCTCTTGATGCCCA-3’。

2.運用CRISPR/Cas9系統敲除番茄SlMYB12的基因編輯方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)gRNA靶位點的選擇

利用CRISPR在線設計工具CRISPR-Plant，根據CRISPR/Cas9技術設計靶位點的原則，把gRNA靶位點設計在SlMYB12基因的上游5’端第一個外顯子上，具體序列為：F:5’-TGGGCATCAAGAGAGGCAGA-3’，R:5’-TCTGCCTCTCTTGATGCCCA-3’；

(2)gRNA靶位點對應oligo二聚體的合成

根據gRNA靶點序列設計oligo并進行合成，oligo序列為：

Target-F：5’-TTGTGGGCATCAAGAGAGGCAGA-3’

Target-R：5’-AACTCTGCCTCTCTTGATGCCCA-3’；

(3)oligo二聚體插入到Cas9/gRNA表達轉化載體中

利用北京唯尚立德生物科技有限公司的植物Cas9/gRNA質粒構建試劑盒，試劑混合比例為：

取最終體系10μL在16℃反應2小時；

(4)載體轉化和陽性克隆鑒定

取步驟(3)的最終體系產物10μL加入到50μL DH5α感受態細胞中，輕彈混勻，冰浴30分鐘，42℃熱激60秒，冰浴2分鐘，加入800μL LB培養液，置于37℃恒溫150rpm搖床，復蘇1小時候涂卡那霉素抗性平板，37℃恒溫培養箱過夜，挑5-10個白色菌落搖菌培養測序，測序引物序列為：5’-GATGAAGTGGACGGAAGGAAGGAG-3’；

(5)農桿菌介導轉化番茄愈傷組織獲得基因編輯植株

以野生型番茄Alisa Craig為材料，進行農桿菌介導的番茄轉化試驗，將測序結果正確的質粒，轉化GV3101農桿菌進行感染轉化，經過潮霉素抗性篩選，抗性愈傷組織分化再生獲得轉基因陽性株系；

(6)突變體陽性株系基因測序和表型驗證

獲得陽性植株后，提取基因組DNA，在靶位點的兩側設計引物，對目的片段進行PCR擴增，將PCR產物進行純化回收，直接進行測序，根據測序結果單堿基峰值判斷靶標基因突變是否純合，如果SlMYB12基因純合突變，觀察T0代突變體植株果實顏色進行表型驗證，如果為雜合突變，收取T0代突變體植株種子，發苗，同樣方法篩選T1代植株中的SlMYB12純合突變體，結合表型觀察驗證；

(7)驗證判斷

經基因組測序和表型驗證為陽性的純合株系，即為完全喪失SlMYB12功能，無外源基因插入的粉紅色番茄果實突變體。

3.根據權利要求2所述的運用CRISPR/Cas9系統敲除番茄SlMYB12的基因編輯方法，其特征在于，所述步驟(2)中將合成的oligo分別稀釋成10μM，按照如下比例混合：

Target-F 5μL

Target-R 5μL

H₂O15μL

取最終體系25μL，混勻后，按照如下程序處理：

95℃3min

95℃到25℃室溫條件下緩慢冷卻

16℃5min。